張 周，盛 浩，袁 紅，段良霞，張 亮

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410128）

玉竹（Polygonatum odoratum(Mill.)Druce），別名鈴鐺菜、尾參、地管子和甜草根，是百合科黃精屬多年生草本植物[1]，富含氨基酸、微量元素、多糖和苷類等化學(xué)成分，可增強(qiáng)人體免疫力，有效延緩衰老、促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化[2]，對人體有較多用處。玉竹既可食用，又可藥用，在我國分布廣泛，較為出名的一種是湖南的湘玉竹，它已成為當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)來源。近年來，由于玉竹連年連片種植，產(chǎn)地病蟲害越來越重，已嚴(yán)重影響玉竹的品質(zhì)，成為玉竹生產(chǎn)開發(fā)的主要障礙[3]。湖南地區(qū)的玉竹大片連作不僅影響其產(chǎn)量和質(zhì)量，對當(dāng)?shù)氐耐寥牢⑸飬^(qū)系和土壤養(yǎng)分也造成不同程度的影響。

連作障礙是指在同一塊土壤中連續(xù)栽培同種或同科作物時(shí)，即使在正常的栽培管理狀況下，也會(huì)出現(xiàn)生長勢變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、病蟲害嚴(yán)重的現(xiàn)象，在日本被稱為“忌地”現(xiàn)象，在歐美國家被稱為“再植問題”，我國稱其為“重茬問題”[4]。植物連作通常會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡、理化性質(zhì)惡變、微生物群落變化、作物自毒物質(zhì)積累等[5]。基于土壤微生物群落變化的研究層面，植物連作后，由于長期受同一類根系分泌物的影響，土壤微生物群落會(huì)發(fā)生選擇性富集，導(dǎo)致土壤微生物群落數(shù)量發(fā)生變化，如連作后土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌等的數(shù)量變化[6]。一般連作年限越長，土壤中微生物群落數(shù)量變化程度越大。為了解釋連作障礙的形成機(jī)理，國內(nèi)外眾多學(xué)者對作物連作問題進(jìn)行研究，分析了造成連作障礙的幾大原因，包括：土壤微生物生物學(xué)環(huán)境改變；土壤酸堿度改變；土壤營養(yǎng)成分改變；植物化感作用。大量試驗(yàn)表明，土壤微生物區(qū)系變化和群落結(jié)構(gòu)、病原微生物數(shù)量改變及植物的化感作用，是造成作物連作障礙主要因素之一[7-14]。

縱觀國內(nèi)外各學(xué)者的大量試驗(yàn)，目前研究連作對土壤生物學(xué)環(huán)境的影響，大多是與保護(hù)地蔬菜連作有關(guān)，如黃瓜、番茄、玉米等，與藥食兼用植物尤其是玉竹的相關(guān)研究少有文獻(xiàn)報(bào)道，其中肖嵐等[3]通過對玉竹根際土壤有機(jī)化合物的鑒定，發(fā)現(xiàn)玉竹連作土壤中有多種化感物質(zhì)，與作物的自毒作用共同造成玉竹的連作障礙，但關(guān)于玉竹連作土壤中微生物區(qū)系的具體分析鮮見報(bào)道。

本文對連作3年的玉竹根際土壤和種植1年的玉竹根際土壤中3大類群土壤微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌）以及主要功能微生物的數(shù)量進(jìn)行了分析，以期初步探明玉竹連作對土壤微生物區(qū)系的影響，為連作障礙機(jī)理研究、提高玉竹的產(chǎn)量和質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)玉竹生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 取樣點(diǎn)概況及取樣方法

供試土壤采集于2018年2月，地點(diǎn)位于長沙縣高橋鎮(zhèn)玉竹種植園，采集對象為連作3年的玉竹根際土壤（板頁巖母質(zhì)風(fēng)化的紅壤），并以種植1年的玉竹根際土壤為對照。

采用五點(diǎn)法選擇采樣對象，小心剝離玉竹植株周圍土壤，并輕輕拔出，收集根表附著土壤作為根際土壤，混勻后按四分法處理，取約500 g樣品裝入塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集到的土壤去除明顯可見的未分解和半分解動(dòng)物、植物殘?bào)w和較大的石礫，用2 mm篩子過篩后裝入滅菌的密封塑料袋，置于4 ℃冰箱保存、備用。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

細(xì)菌[15]：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、水1 L、瓊脂18 g）。

放線菌[15]：改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基（淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO31 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 3 g、水1 L、瓊脂18 g）。

真菌[15]：馬丁培養(yǎng)基（葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、10 g/L孟加拉紅液3.3 mL、水1 L、瓊脂18 g）。

好氧自生固氮菌[15]：瓦克斯曼77號培養(yǎng)基（葡萄糖10 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、FeCl3·6H2O微量、MnSO4·4H2O微量、10 g/L剛果紅溶液5 mL、蒸餾水1 L、瓊脂18 g）。

氨化細(xì)菌[15]：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.5 g、蒸餾水1 L、K2HPO40.5 g、瓊脂18 g）。

硝化細(xì)菌[15]：氨氧化細(xì)菌（亞硝化細(xì)菌）培養(yǎng)基（CaCO35 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、(NH4)2SO42 g、MnSO4·4H2O 0.01 g、K2HPO40.75 g、蒸餾水1 L、NaH2PO40.25 g）。

有機(jī)磷細(xì)菌[15]：蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基（葡萄糖 10 g、NaCl 0.3 g、CaCO35 g、卵磷脂 0.2 g、（NH4)2SO40.5 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.3 g、蒸餾水1 L）。

無機(jī)磷細(xì)菌[15]：磷酸三鈣無機(jī)磷培養(yǎng)基（葡萄糖10 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、Ca3(PO4)210 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、(NH4)2SO40.5 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、NaCl 0.3 g、蒸餾水1 L、KCl 0.3 g）。

格利斯試劑A液[15]：0.5 g對氨基苯磺酸加到150 mL 200 g/L的乙酸溶液中；B液：1 g酸溶萘胺加到20 mL蒸餾水和150 mL 200 g/L的乙酸溶液中。40 g/L的鉬酸銨試劑：18 g化學(xué)純鉬酸銨結(jié)晶溶于420 mL蒸餾水，漸漸加入30 mL濃硫酸，充分振蕩，使結(jié)晶完全溶解，保存在棕色玻璃瓶中待用。還原劑：15 g化學(xué)純亞硫酸氫鈉溶于250 mL蒸餾水中，加入1.5 g亞硫酸鈉和1，2，4-氨基萘酚磺酸，完全溶解后，用蒸餾水稀釋至500 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 3大土壤微生物的計(jì)數(shù)

分別稱取10 g新鮮連作土樣和對照土樣，加入盛有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，置于搖床中振蕩15 min，制備使土樣均勻地分散在稀釋液中的土壤懸液；吸取0.5 mL土壤懸液到4.5 mL無菌水中，按10倍法依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液[15]。

細(xì)菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養(yǎng)基表面的懸液涂抹均勻，每一個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)。將平板倒置，在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)3～4 d后觀察并計(jì)數(shù)。

放線菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-4、10-5稀釋土壤懸液，接入改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養(yǎng)基表面的懸液涂抹均勻，每一個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)。將平板倒置，28 ℃培養(yǎng)5～7 d后觀察并計(jì)數(shù)。

真菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-2、10-3稀釋土壤懸液，接入馬丁培養(yǎng)基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養(yǎng)基表面的懸液涂抹均勻，每一個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)。將平板倒置，在培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)2～3 d后觀察并計(jì)數(shù)。

1.3.2 主要功能土壤微生物計(jì)數(shù)

好氧自生固氮菌：用0～100 μL固氮移液槍各吸取100 μL 10-2、10-3稀釋土壤懸液，接入瓦克斯曼77號培養(yǎng)基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養(yǎng)基表面的懸液涂抹均勻，每一個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)。將平板倒置，在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察并計(jì)數(shù)[15]。

氨化細(xì)菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養(yǎng)基表面的懸液涂抹均勻每一個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)。將平板倒置，在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5～7 d后觀察并計(jì)數(shù)[15]。

硝化細(xì)菌：用1.0～5.0 mL移液槍各吸取1 mL 10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入裝有5 mL氨氧化細(xì)菌（亞硝化細(xì)菌）培養(yǎng)基的試管中，每一個(gè)稀釋度接種3個(gè)試管，另取2只培養(yǎng)基接種無菌水作對照。在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)14 d，吸取培養(yǎng)液5滴于白瓷板穴中，依次加入格利斯試劑A液、B液各1滴，如有亞硝酸（NO2）存在，則呈紅色，表示亞硝酸化細(xì)菌存在。依據(jù)“最大或然數(shù)法”計(jì)算結(jié)果[15]。

有機(jī)磷細(xì)菌：用1.0～5.0 mL移液槍各吸取1 mL 10-4、10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入裝有5 mL蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基的試管中，每一個(gè)稀釋度4個(gè)重復(fù)，另取6只培養(yǎng)基接種無菌水作對照。在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d，加40 g/L的鉬酸銨試劑2 mL于試管中，在沸水浴中加熱2 min。取出后加入還原劑1 mL，有磷酸時(shí)呈藍(lán)色反應(yīng)。依據(jù)“最大或然數(shù)法”計(jì)算結(jié)果[15]。

無機(jī)磷細(xì)菌：用0～100 μL移液槍各吸取100 μL 10-5、10-6稀釋土壤懸液，接入磷酸三鈣無機(jī)磷培養(yǎng)基表面，立即用玻璃刮刀將接入培養(yǎng)基表面的懸液涂抹均勻，每一個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)。將平板倒置，在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察并計(jì)數(shù)[15]。

1.4 微生物數(shù)量計(jì)算公式

1.4.1 涂布法

菌數(shù)＝（菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×20×鮮土質(zhì)量）/干土質(zhì)量，單位為CFU/g[15]。

1.4.2 最大或然數(shù)法

菌數(shù)＝（近似值×數(shù)量指標(biāo)首位稀釋倍數(shù)×鮮土質(zhì)量）/干土質(zhì)量，單位為CFU/g[15]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪制圖表，采用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉竹連作對土壤3大類群微生物區(qū)系的影響

玉竹連作影響土壤3大類群微生物的區(qū)系，由表1知，連作玉竹根際土壤與種植1年玉竹的土壤3大類群微生物的數(shù)量均表現(xiàn)為細(xì)菌＞放線菌＞真菌。與對照相比，連作土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量均減少，而真菌的數(shù)量增多。連作根際土壤細(xì)菌、放線菌總數(shù)分別比對照降低了12.4%、13.2%，且均與對照差異顯著。連作根際土壤真菌總數(shù)達(dá)1.05×106CFU/g，較對照顯著增加了239%。

2.2 玉竹連作對土壤功能微生物的影響

2.2.1 玉竹連作對土壤好氧自生固氮菌、氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌數(shù)量的影響

從圖1可以看出，連作玉竹根際土壤中的好氧自生固氮菌和氨化細(xì)菌數(shù)量均少于種植1年玉竹的土壤中的數(shù)量，而硝化細(xì)菌數(shù)量則大致相同。其中，連作玉竹根際土壤中好氧自生固氮菌的數(shù)量為2.51×106CFU/g，氨化細(xì)菌的數(shù)量為2.74×107CFU/g，種植1年玉竹的土壤中好氧自生固氮菌的數(shù)量為3.87×106CFU/g，氨化細(xì)菌的數(shù)量為5.33×107CFU/g。經(jīng)過分析，連作后土壤中的好氧自生固氮菌數(shù)量僅為種植1年玉竹的土壤中的64.9%，數(shù)量變化差異未達(dá)到顯著水平。連作根際土壤中的氨化細(xì)菌的數(shù)量較種植1年玉竹的土壤中的數(shù)量減少了將近36.3%，數(shù)量變化差異顯著。連作玉竹根際土壤中硝化細(xì)菌的數(shù)量和種植1年玉竹的土壤中硝化細(xì)菌的數(shù)量均大約為1.45×106CFU/g，分別占連作玉竹根際土壤和種植1年玉竹的土壤中的細(xì)菌總數(shù)的0.004 2和0.003 7。

2.2.2 玉竹連作對土壤有機(jī)磷細(xì)菌、無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量的影響

從圖2可知，種植1年玉竹的土壤中的有機(jī)磷細(xì)菌的數(shù)量為1.45×106CFU/g，連作玉竹根際土壤中的有機(jī)磷細(xì)菌的數(shù)量為1.65×106CFU/g，兩者相差約12.1%。連作玉竹根際土壤和種植1年玉竹的土壤中的有機(jī)磷細(xì)菌的數(shù)量相差不多，但連作玉竹土壤中無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量為1.24×107CFU/g，對照土壤中無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量為4.29×107CFU/g，約是連作玉竹根際土壤中無機(jī)磷細(xì)菌的3.5倍。

3 結(jié)論與討論

土壤中的細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量是衡量土壤中微生物區(qū)系狀況的一個(gè)重要指標(biāo)。大量研究表明，連作后土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量急劇下降，真菌的數(shù)量顯著上升。劉曄等[16]對不同連作年限對植煙土壤微生物區(qū)系的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、放線菌數(shù)量隨連作年限的增加而減少，但真菌數(shù)量變化相反，隨著連作年限的增加而增加。黃玉茜等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，隨連作年限增加，花生根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量和放線菌數(shù)量減幅明顯，同時(shí)真菌數(shù)量增加幅度較大。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過3年的連作，細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著減少，而真菌的數(shù)量則大幅度增加。土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增加，會(huì)使得植物很容易被土傳病害感染，同時(shí)土壤的肥力也會(huì)在一定程度上被削弱。

表1 細(xì)菌、放線菌與真菌數(shù)量

圖1 玉竹連作對土壤好氧自生固氮菌、氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌數(shù)量的影響

圖2 玉竹連作對土壤有機(jī)磷細(xì)菌和無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量的影響

除了土壤中的3大類群微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌）的數(shù)量在連作后會(huì)發(fā)生明顯變化，土壤中的功能微生物數(shù)量也會(huì)發(fā)生一定的變化。連作玉竹根際土壤中的好氧自生固氮菌、氨化細(xì)菌、無機(jī)磷細(xì)菌的數(shù)量均有不同程度的減少，而有機(jī)磷細(xì)菌和硝化細(xì)菌的數(shù)量變化不大。功能微生物的減少，會(huì)導(dǎo)致土壤中的微生物量碳和微生物量氮相對減少，從而影響植物的生長質(zhì)量和最終的產(chǎn)量。

連作年限的增加，會(huì)使得土壤微生物的區(qū)系發(fā)生變化，從而影響玉竹生長的土壤環(huán)境，進(jìn)而影響玉竹的產(chǎn)量、質(zhì)量，甚至影響連作地塊的土壤肥力。故采取一定的措施如合理的施用有機(jī)肥和無機(jī)肥改善土壤中微生物的區(qū)系，對改良土壤和植物良好生長有一定的穩(wěn)定作用。