高學(xué)金，呂昕雨，金 辰

(北京工業(yè)大學(xué)信息學(xué)部，數(shù)字社區(qū)教育部工程研究中心，城市軌道交通北京實驗室，計算智能與智能系統(tǒng)北京市重點實驗室， 北京 100124 )

0 引言

發(fā)酵控制中，葡萄糖濃度的檢測是整個過程中最重要的流程之一。不同階段的發(fā)酵過程中所需葡萄糖量是不同的，葡萄糖濃度的過高或過低都會影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量與質(zhì)量[1]。傳統(tǒng)的葡萄糖分析儀多數(shù)采用蠕動泵直接抽取進樣的方式對待測液進行檢測。本課題組曾經(jīng)研制的酶注射式葡萄糖分析儀[2]，采用同時抽取酶液和葡萄糖待測液進入傳感器內(nèi)部的方式進行檢測。但是內(nèi)部流路十分復(fù)雜，驅(qū)動電路較多，不僅容易產(chǎn)生噪聲同時檢測時間過長，不利于在線檢測[3]。因此，有必要對流路結(jié)構(gòu)以及生物傳感器進行創(chuàng)新和簡化。

微流控芯片技術(shù)始于20世紀80年代，該技術(shù)是把生物、化學(xué)檢測分析過程的樣品提取、反應(yīng)、分離、檢測等基本功能集成到一塊μm量級尺度的芯片上完成分析全過程[4-5]。它在多個領(lǐng)域擁有較大的研究和應(yīng)用前景，已經(jīng)發(fā)展成為一個集合有生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、電子、流體、材料、機械等多學(xué)科交叉的研究領(lǐng)域。為適應(yīng)時代的需求，現(xiàn)今的研究多集中在集成分析方面，特別是生物傳感器的研究。

本文設(shè)計一款帶有Y型和S型混合流道[6]的微流控芯片，作為葡萄糖生物傳感器的主體部分。運用蠕動泵負壓驅(qū)動進樣的方式抽取液體[7～9]，即在蠕動泵產(chǎn)生負壓的情況下，將液態(tài)的葡萄糖氧化酶溶液與葡萄糖溶液抽入微流控芯片內(nèi)部，使其混合溶液在工作電極處發(fā)生酶促反應(yīng)，并對其響應(yīng)電流進行檢測，得出葡萄糖濃度。

通過相關(guān)實驗研究，驗證了所研制檢測系統(tǒng)在線使用的可行性。

1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

1.1 基于負壓的微流控葡萄糖生物傳感在線檢測系統(tǒng)

為了減少分析儀的噪聲源，簡化裝置，本文采用負壓驅(qū)動的方式，采用蠕動泵抽取微流控芯片從而產(chǎn)生負壓，抽取酶液和葡萄糖待測液?；谝陨线M樣原理，本文搭建一種負壓驅(qū)動的微流控葡萄糖在線檢測系統(tǒng)，其流路結(jié)構(gòu)如圖1所示。系統(tǒng)主要由微控制器(MCU)運算處理系統(tǒng)、三電極檢測信號調(diào)理系統(tǒng)、微流控葡萄糖生物傳感器反應(yīng)系統(tǒng)以及負壓驅(qū)動裝置等構(gòu)成。

圖1 微流控葡萄糖在線檢測系統(tǒng)原理圖

系統(tǒng)工作過程如下：首先在負壓驅(qū)動裝置的作用下，抽取出葡萄糖溶液和葡萄糖氧化酶溶液，2種溶液進入微流控葡萄糖生物傳感器反應(yīng)系統(tǒng)充分混合，并在工作電極處發(fā)生酶促反應(yīng)，產(chǎn)生與待測液中葡萄糖濃度成比例的電流信號。捕獲的電流信號經(jīng)過三電極電路的I/V變換，將電壓信號傳遞給微控制器(MCU)運算處理系統(tǒng)進行運算處理，最終得到葡萄糖濃度。

1.2 微流控葡萄糖生物傳感器反應(yīng)系統(tǒng)

為了解決目前葡萄糖生物傳感器存在的響應(yīng)時間慢，檢測時間較長，以至不利于在線使用的問題，本文提出了一種采用微流控技術(shù)的酶注射式葡萄糖生物傳感器，采用S型微流控混合流道，設(shè)計出一種微流控葡萄糖生物傳感器。

運用多物理場耦合分析軟件進行數(shù)值模擬，經(jīng)過驗證，采用Y型和S型流道相結(jié)合的微流控芯片擁有較好的液體混合以及響應(yīng)效果，芯片結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 微流控葡萄糖生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖

傳感器工作原理：首先，蠕動泵在出液口產(chǎn)生負壓，葡萄糖溶液和酶液再從進樣口進入微流控內(nèi)部流道，流經(jīng)Y型通道和S型通道充分混合之后，進入六邊形的微反應(yīng)器，在工作電極的作用下，發(fā)生電化學(xué)酶促反應(yīng)。電極捕獲電流，經(jīng)過I/V變換調(diào)理，經(jīng)微處理器運算處理得到對應(yīng)的葡萄糖濃度。

葡萄糖與葡萄糖氧化酶的電化學(xué)反應(yīng)機理：

(1)

(2)

式中：D-Glucose為葡萄糖；D-Glucose_acid為葡萄糖酸；GOD為葡萄糖氧化酶；Pt為鉑。

該反應(yīng)的速率(mol/m3)是由Michaelis-Mentenf方程來描述：

R=(CglucoseVmax)/(1+KmCglucose)

(3)

式中：Vmax為酶催化反應(yīng)的最大速率，根據(jù)可用酶的數(shù)量來選擇；Km為米氏常數(shù)，在葡萄糖濃度大的情況下，速率與葡萄糖濃度無關(guān)，完全取決于酶動力學(xué)；Cglucose為葡萄糖底物濃度。

區(qū)別于第一代葡萄糖分析儀樣品需要先抽取，再將反應(yīng)液體注射入傳感器進行檢測的方式，本文設(shè)計的微流控葡萄糖生物傳感器采用負壓驅(qū)動微流控芯片，以此抽取酶液和葡萄糖待測液的方式來檢測葡萄糖濃度。

微流控芯片采用PMMA材料，該材料具有一定的耐腐蝕性，不易老化，耐高溫。因此，本傳感器很適合在發(fā)酵現(xiàn)場進行在線檢測時使用。

1.3 三電極檢測信號調(diào)理系統(tǒng)

本文采用三電極檢測電路來對電極捕獲的電信號進行變換調(diào)理，其原理主要是：為三電極提供恒定電位，在工作電極處接收電流信號，并進行I/V變換。

三電極檢測電路的電路原理圖如圖3所示，主要由3個運放組成。其中，OP2構(gòu)成電壓跟隨器，OP2與OP1構(gòu)成恒電位提供電路。OP3與Rf構(gòu)成I/V變換電路。所用運放均選用輸入偏流小的運放CA3140。

圖3 三電極檢測電路原理圖

為了對I/V變換后的信號進行低通濾波和工頻50 Hz濾波，本文設(shè)計了低通濾波及50 Hz陷波濾波電路，其電路原理圖如圖3所示。OP4亦選用輸入偏流小的運放CA3140。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 實驗試劑

葡萄糖標準溶液來自山東省科學(xué)院生物研究所。磷酸鹽緩沖液由山東省科學(xué)院生物研究所SBA系列分析儀專用緩沖劑添加蒸餾水配制。葡萄糖氧化酶溶液，由葡萄糖氧化酶(型號G7141，312 U/mg，美國Sigma公司)添加磷酸鹽緩沖液配制。

2.2 傳感器響應(yīng)特性對比實驗

本文選取的葡萄糖質(zhì)量濃度范圍是0～100 mg/dL。實驗中選取的葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、25、50、100 mg/dL，蠕動泵的速度設(shè)置為5 mL/h。通過對酶注射式葡萄糖生物傳感器以及自行研制的微流控葡萄糖生物傳感器分別做響應(yīng)特性實驗，圖4為葡萄糖濃度為50 mg/dL條件下，微流控葡萄糖生物傳感器電流響應(yīng)曲線。從圖4中可以看出，在葡萄糖濃度50 mg/dL條件下，電流大小隨時間變化呈逐漸上升趨勢，且微流控葡萄糖生物傳感器的響應(yīng)時間僅需要15 s左右，明顯短于酶注射式葡萄糖生物傳感器的響應(yīng)時間——120 s。

圖4 微流控葡萄糖生物傳感器電流響應(yīng)曲線

2.3 傳感器響應(yīng)電流線性相關(guān)度曲線

對應(yīng)葡萄糖7個濃度0、1、5、10、25、50、100 mg/dL，傳感器的響應(yīng)電流校正曲線如圖5所示，在0～100 mg/dL葡萄糖濃度范圍內(nèi)，傳感器電流響應(yīng)值隨著葡萄糖濃度的增大而成比例的增大。

圖5 傳感器響應(yīng)電流隨濃度的變化趨勢

3 結(jié)論

本文研制了基于負壓的微流控葡萄糖生物傳分析系統(tǒng)，“負壓驅(qū)動”的設(shè)計以及微流控技術(shù)的引入設(shè)計突破了傳統(tǒng)分析儀的樣品進樣和檢測方法。最后通過實驗驗證了所研制分析儀在0～100 mg/dL葡萄糖濃度范圍內(nèi)是線性的；通過對比實驗驗證了傳感器具有較高的靈敏度，響應(yīng)電流在15 s左右達到最大值，基本滿足在線測量的要求。微流控芯片具有取樣量小，響應(yīng)速度快的特點。