王 瑩，吳 晗，李志軍，張永紅，李煥榮，李秋明*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)可通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞運(yùn)輸、炎性因子產(chǎn)生和與MHC-II分子相關(guān)的抗原遞呈，使宿主對(duì)傳染因子發(fā)生應(yīng)答[1]。地塞米松(DSMS)是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，普遍作為抗炎、抗過敏藥使用[2]。有研究顯示，地塞米松直接作用于單核細(xì)胞，對(duì)其分化具有明顯的抑制作用[3]，并且內(nèi)皮源IL-8可在早期抑制體外培養(yǎng)的MoDC成熟[4]。

那么DSMS作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，使內(nèi)皮源IL-8的分泌量降低，是否會(huì)間接對(duì)MoDC遷移與內(nèi)源性抗原遞呈功能有影響尚未見報(bào)道。本研究將模擬DSMS進(jìn)入機(jī)體后刺激VEC，分別與分化和未分化的MoDC進(jìn)行共培養(yǎng)，通過熒光定量PCR和多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)，研究DSMS刺激VEC對(duì)MoDC遷移能力與抗原遞呈功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

細(xì)胞為豬髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系(PIEC),購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，目錄號(hào)是GN015。試驗(yàn)動(dòng)物為長(zhǎng)白、大白雜交斷奶后仔豬，購(gòu)自首農(nóng)集團(tuán)種豬育種中心，飼養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物房?jī)?nèi)。所有試驗(yàn)動(dòng)物均通過PCR/RT-PCR檢測(cè)PCV1、PCV2、PRRSV、PRV、PPV、CSFV病原，且結(jié)果均為陰性。地塞米松，購(gòu)自阿拉丁公司；重組豬GM-CSF和IL-4，購(gòu)自R&D公司，-20 ℃保存；超氧化物陰離子探針(Dihydroethidium，DHE)，購(gòu)自碧云天公司；無酚紅RPMI 1640，購(gòu)自Gibco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DSMS質(zhì)量濃度篩選 常規(guī)方法培養(yǎng)PIEC，培養(yǎng)液使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液。將細(xì)胞數(shù)量稀釋為3×105個(gè)/孔，接種于無菌24孔板內(nèi)，此時(shí)所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同質(zhì)量濃度的DSMS，其質(zhì)量濃度分別為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL。分別在48 h和5 d兩個(gè)時(shí)間段收集細(xì)胞上清液，所收集的上清液通過ELISA檢測(cè)IL-8的變化量，從而篩選出DSMS可下調(diào)IL-8分泌的合適質(zhì)量濃度，用于后續(xù)研究。

1.2.2 CD14+單核細(xì)胞的純化與誘導(dǎo)培養(yǎng) 采集豬前腔靜脈外周血，參照文獻(xiàn)[5]中的方法分離并純化CD14+單核細(xì)胞，將其誘導(dǎo)為MoDC。

共培養(yǎng)方式分為兩種，分別為誘導(dǎo)共培養(yǎng)與誘導(dǎo)后共培養(yǎng)。

誘導(dǎo)共培養(yǎng)是將分選出來的CD14+單核細(xì)胞接種在trans-well上室后直接與預(yù)先鋪有PIEC的24孔培養(yǎng)板共培養(yǎng)；誘導(dǎo)后共培養(yǎng)是將CD14+細(xì)胞誘導(dǎo)為MoDC后，再轉(zhuǎn)入預(yù)先鋪有PIEC的24孔板中培養(yǎng)。

設(shè)置分組為DC單獨(dú)培養(yǎng)組、PIEC共培養(yǎng)組、DSMS共培養(yǎng)組。每個(gè)分組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。

DC組為CD14+細(xì)胞加入正常的誘導(dǎo)液；PIEC共培養(yǎng)組為CD14+細(xì)胞與PIEC中加入正常的誘導(dǎo)液；DSMS共培養(yǎng)組為CD14+細(xì)胞與PIEC中加入含有DSMS的誘導(dǎo)液。

1.2.3 MoDC遷移能力檢測(cè) 收集MoDC并用HDE標(biāo)記，37 ℃孵育45 min后，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞至5×105個(gè)/mL，取100 μL標(biāo)記好的MoDC加入到預(yù)先鋪好的24孔transwell(5.0 μm)上室，下室加入質(zhì)量濃度為200 ng/mL MCP-1的無血清RPMI 1640培養(yǎng)。37 ℃孵育8 h后，立即用多功能全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)定下室內(nèi)細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度以分析細(xì)胞的相對(duì)遷移能力。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)源性抗原遞呈分子 收集各組MoDC后提取總RNA，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，對(duì)所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA，RNA模板定量為2 μg。參考文獻(xiàn)[6]中各分子引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

表1 細(xì)胞因子與β-actin Real-time FQ-PCR的擴(kuò)增引物和PCR反應(yīng)條件Tab.1 Primers and PCR conditions of real-time FQ-PCR for cytokines and β-actin

2 結(jié) 果

2.1 DSMS刺激PIEC質(zhì)量濃度選擇

DSMS刺激PIEC 48 h和5 d后，IL-8的分泌量變化見圖1。當(dāng)DSMS的質(zhì)量濃度為10-3mg/mL時(shí)，48 h(圖1A)與5 d(圖1B)兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)PIEC中IL-8的分泌量均顯著下降。選擇10-3mg/mL的DSMS質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。note：* means P<0.05.圖1 不同質(zhì)量濃度的DSMS刺激PIEC 48 h(A)和5 d(B)后IL-8的變化Fig.1 Changes of IL-8 concentration in PIEC stimulated by different concentrations of DSMS in 48 h(A) and 5 d(B)

2.2 MoDC遷移能力檢測(cè)

由圖2可見，其他兩種共培養(yǎng)方式的MoDC熒光強(qiáng)度顯著低于MoDC單獨(dú)培養(yǎng)組，盡管DSMS共培養(yǎng)組熒光強(qiáng)度高于未刺激共培養(yǎng)組，但差異不顯著。表明DSMS在與PIEC、MoDC共培養(yǎng)過程中，對(duì)其遷移能力影響不大。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。兩種共培養(yǎng)方式中，各組的UBP mRNA和calreticulin mRNA未見明顯變化，而對(duì)LMP7 mRNA和MHC-I mRNA的檢測(cè)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)中表達(dá)水平均顯著低于DC單獨(dú)培養(yǎng)組，且DSMS共培養(yǎng)組中表達(dá)水平明顯高于PIEC共培養(yǎng)組，提示DSMS可上調(diào)LMP7 mRNA和MHC-I mRNA的表達(dá)。

注：同一共培養(yǎng)方式中標(biāo)注*表示差異顯著(P<0.05)。Note: * mean significant difference in the same method of co-culture (P<0.05).圖2 兩種不同共培養(yǎng)方式中MoDC的遷移能力Fig.2 Migration of MoDC in two differentconditions of co-culture

注：同一共培養(yǎng)方式中標(biāo)注*表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: * mean significant difference (P<0.05) and ** mean very significant difference (P<0.01) in the same method of co-culture.圖3 MoDC中內(nèi)源性抗原遞呈分子的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of endogenous antigen presenting molecules in MoDC

3 討 論

DSMS作為一種典型的糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗過敏、抗病毒的藥理作用。研究顯示，DSMS可以抑制上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌IL-8[7]，本試驗(yàn)通過檢測(cè)DSMS作用PIEC后IL-8分泌情況，篩選具有抑制IL-8分泌的合適質(zhì)量濃度，以探索DSMS對(duì)單核樹突狀細(xì)胞免疫作用的影響。

當(dāng)外周的DC識(shí)別抗原后，攝取攜帶抗原穿過淋巴管，向淋巴結(jié)遷移，最終到達(dá)次級(jí)淋巴器官，將抗原遞呈給初始T細(xì)胞和B細(xì)胞并激活[8]，只有DC從外周遷移到次級(jí)淋巴器官時(shí)，才能激活免疫反應(yīng)，所以DC的遷移過程對(duì)于T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)至關(guān)重要[9]，攝取到病毒的DC成功遷移到淋巴器官是內(nèi)源性抗原遞呈功能的關(guān)鍵。本研究顯示在兩種共培養(yǎng)方式中，PIEC共培養(yǎng)組與DSMS共培養(yǎng)組MoDC的遷移能力均顯著低于DC單獨(dú)培養(yǎng)組，但PIEC共培養(yǎng)組與DSMS共培養(yǎng)組相比并沒有明顯差異，說明PIEC可降低MoDC的遷移能力，而DSMS對(duì)MoDC遷移能力的影響并不大。

LMP7和UBP在促進(jìn)抗原肽生成過程中起到關(guān)鍵性作用。LMP7可以上調(diào)蛋白酶體對(duì)疏水性和堿性氨基酸殘基肽鍵的斷裂[4]，產(chǎn)生更適合肽段與MHC-I優(yōu)先結(jié)合[10]。有研究表明LMP7基因敲除的小鼠顯示出MHC-I抗原遞呈功能顯著下降[11]。UBP能阻止蛋白酶體降解目的蛋白，控制抗原肽的合成[12-13]。Calnexin能促進(jìn)MHC-I重鏈和輕鏈的結(jié)合，保護(hù)重鏈免受降解。Calnxin在MHC-I異構(gòu)化后被鈣網(wǎng)蛋白取代。鈣網(wǎng)蛋白的缺失直接導(dǎo)致MHC-I不能負(fù)載抗原肽并降低MHC-I的穩(wěn)定性[14-15]，進(jìn)而導(dǎo)致抗原肽生成受到抑制、抗原遞呈功能也會(huì)顯著下降。本研究顯示兩種共培養(yǎng)中，經(jīng)過DSMS刺激后的分組中，UBP mRNA和calreticulin mRNA變化不明顯，而LMP7 mRNA與MHC-I mRNA的變化顯著高于未刺激組，表明DSMS引起的內(nèi)皮源IL-8下調(diào)后抗原肽的生成不再受到抑制，MHC-I mRNA與抗原復(fù)合肽能夠順利結(jié)合，從而有利于內(nèi)源性抗原遞呈能力的提升。DSMS對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響是否與髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞一致有待進(jìn)一步探索。

總之，DSMS的刺激可下調(diào)內(nèi)皮源IL-8的分泌，DSMS刺激PIEC后，對(duì)MoDC遷移能力沒有影響，但可上調(diào)MoDC中LMP7 mRNA和MHC-I mRNA的表達(dá)水平，為進(jìn)一步完善DSMS的作用機(jī)理提供思路。