袁昭弟1，焦后意1，劉 凱1，周麗潔，余顯權(quán)

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)水稻研究所，貴陽 550025)

水稻在我國糧食生產(chǎn)中占有重要的地位[1]。有色稻不僅含有豐富的營養(yǎng)元素，還含有豐富的生物活性物質(zhì)[2-4]。因此，有色稻常被用來改善體質(zhì)和預(yù)防各種疾病。

花色苷是一種分布范圍廣、安全、無毒、無副作用的天然色素。在自然界中通過糖苷鍵與一個或多個葡萄糖、鼠李糖、半乳糖等合成花色苷。該色素的糖苷基與羥基還可以經(jīng)過酯鍵和一個或少許分子的對位香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等合成牢固的花色苷[5-6]。

OsPAL是參與該色素生化反應(yīng)的第一個酶，能在水稻的所有部位表達(dá)，其中根和莖中的表達(dá)比其他部位高[7-8]。OsCHS在水稻的所有部位均有表達(dá)，其中莖和種子中的表達(dá)量比較高，且開花后13 d的種子表達(dá)量顯著高于開花后2、7 d的表達(dá)量[9]。OsF3H它的表達(dá)量在開花后13 d的黑米種子中最高[7-8]。Kim等克隆了水稻的3個OsF3H序列，F(xiàn)3H-2在所有組織中的表達(dá)量最高但在種子中不表達(dá)[10]。Ryu等[11]分析了10個色稻品種，認(rèn)為色稻籽粒中相對于OsF3′5′H來說，OsF3′H的表達(dá)占優(yōu)勢,使得下游途徑由二氫槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)經(jīng)過OsDFR、OsANS以及OsUFGT基因的催化而合成花色苷。Phoka等[11]對水稻花色苷含量運用RT-PCR方法,得出OsDFR表達(dá)量的多少受溫度變化的影響,高溫使它的表達(dá)量降低，并且該基因表達(dá)量高低直接影響花色苷積累量。OsANS在黑米花13 d后的表達(dá)量最高，在白米中也有少量表達(dá)[7-8]。

因此，研究水稻花色苷的合成可以通過分子輔助育種的手段，培育出富含花色苷的稻米。本文研究了結(jié)構(gòu)基因(OsPAL、OsCHS、OsCHI、OsF3′H、OsF3′H、OsDFR、OsANS、OsF3′5′H、OsUFGT)在白米和紅米水稻的莖、葉以及開花后不同時期種子中的差異表達(dá)，為進(jìn)一步了解花色苷在水稻中的積累情況提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究選用紅米品種貴紅1號×白米恢復(fù)系蜀恢498 F5群體中表現(xiàn)優(yōu)良、籽粒具有優(yōu)質(zhì)性狀的1份白米株系、1份紅米株系及白米恢復(fù)系蜀恢498(父本)、營養(yǎng)價值高、口感好的紅米品種貴紅1號(母本)。

1.2 方 法

1.2.1試驗設(shè)計

本試驗在貴州大學(xué)水稻試驗場進(jìn)行(盆栽)，2018年4月18日播種，2018年5月28日移栽，每個材料移栽15株，管理方法和壤與大田一樣。待生長適宜后，取各個材料的莖和葉，各材料開花后，使用不同顏色的記號筆標(biāo)記當(dāng)天開花的穗子，每隔7 d取穗子(取樣時間見表1)，保存于-80 ℃冰箱中用于花色苷含量測定和提取RNA。

表1 不同材料種子的取樣時間 (單位：月-日)

表2 熒光定量PCR所用引物及各引物的退火溫度

1.2.2測定項目與方法

1)花色苷含量測定方法參照黃瑩瑩[13]的方法，利用分光光度計法進(jìn)行測定。

2)樣品總RNA提取與cDNA合成參照EASYspin Plus多糖多酚復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物)，提取總RNA，cDNA合成參照EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(雷欣公司)試劑盒的說明書進(jìn)行。

3)Real-time PCR所用的內(nèi)參基因Actin引物參考趙海軍等[14]的方法；OsPAL、OsCHS、OsCHI參考劭雅芳等[15]的方法；OsF3′H、OsDFR、OsANS參考Sun-Hyung Lim等[16]的方法；OsF3′H參考Tian Shao等[17]的方法；根據(jù)GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中注釋的栽培稻花色苷合成途徑關(guān)鍵酶的基因OsF3′5′H(AP 004704.3)下同、OsUFGT(GQ 280269.1)的mRNA作為參考序列，用Primer Premier 6軟件設(shè)計。熒光定量PCR所用引物、片段大小及退火溫度見表2，實時定量PCR操作根據(jù)TransStart?Tip Green qPCR SuperMix(雷欣公司)試劑盒使用說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系20μL，其中2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10μL，上下游引物0.4μL，Nuclease-free Water 8.7μL，cDNA 0.5μL。重復(fù)3次，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃(58.3 ℃、50.7 ℃)退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)。根據(jù)Actin基因的表達(dá)量，以2-ΔΔCt法計算各基因相對表達(dá)量。

4)本研究采用比較閾值法(2-ΔΔCt)對不同材料的結(jié)構(gòu)基因的Real-time PCR測定結(jié)果進(jìn)行相對定量分析，采用SPSS 20.0軟件、Excel 2010軟件和DPS 7.05統(tǒng)計軟件對花色苷含量顯著性分析、不同時期花色苷含量變化、花色苷結(jié)構(gòu)基因在種子發(fā)育不同時間的動態(tài)變化和基因表達(dá)量之間與花色苷含量的相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 參試材料花色苷含量差異分析

由參試材料的花色苷含量測定結(jié)果(表3)看出，紅米材料和白米材料從開花后，隨著取樣期的推遲，紅米材料花色苷含量逐漸增加，而白米材料反之。白米材料從開花后7 d花色苷含量較高，差異不明顯，但極顯著高于紅米材料，其余取樣時間紅米材料花色苷含量較高，差異較明顯，并極顯著高于白米材料。開花后7～14 d，2個親本花色苷的含量顯著高于2個株系，而開花后14～21 d反之，但其他2個時期親本和株系花色苷含量差異不明顯，說明花色苷是形成色稻的主要色素之一。

表3 2個親本和2個株系籽?；ㄉ蘸?/p>

注：表中分別對親本、白米株系和紅米株系進(jìn)行差異分析，小寫和大寫字母不同分別表示在5%和1%水平差異顯著性。

2.2 參試材料花色苷含量的動態(tài)變化

由參試材料不同天數(shù)的花色苷含量測定結(jié)果(圖1)看出，紅米品種貴紅1號和紅米株系的花色苷含量隨著種子的發(fā)育而不斷增加，而白米恢復(fù)系蜀恢498和白米株系反之。開花后7～14 d，白米恢復(fù)系蜀恢498的花色苷含量明顯高于白米株系，而14～21 d反之；開花后7 d，白米材料的花色苷含量明顯高于紅米材料的花色苷含量，其他時間反之。開花后7～14 d和21～28 d紅米品種貴紅1號的花色苷含量比紅米株系較高，其他時間反之。說明色稻材料花色苷的含量明顯高于白米材料，而親本和株系的花色苷含量有差異。

表4 2個親本和2個株系花色苷合成結(jié)構(gòu)基因在莖、葉的相對表達(dá)量貴紅1號是紅米品種貴紅1號，蜀恢498是白米恢復(fù)系蜀恢498。

注：表中對合成花色苷結(jié)構(gòu)基因在親本和株系中相對表達(dá)量差異分析，小寫和大寫字母不同分別表示在5%和1%水平差異顯著性；

表5 花色苷含量與色苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的相關(guān)分析

注：“*”和“**”分別表示在5%和1%水平上顯著相關(guān)。

圖1 不同材料花色苷含量的動態(tài)變化

2.3 花色苷合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)特性

2.3.1花色苷合成結(jié)構(gòu)基因在不同組織的表達(dá)特性

由花色苷合成結(jié)構(gòu)基因相對表達(dá)量測定結(jié)果(表4)看出，在紅米品種貴紅1號中，OsPAL、OsCHS在葉和莖相對表達(dá)量最高；在白米恢復(fù)系蜀恢498中，OsCHI、OsF3H、OsDFR、OsANS、OsUFGT等5個基因在葉中相對表達(dá)量最高，OsPAL、OsCHS、OsCHI、OsF3′5′H、OsUFGT等5個基因在莖中相對表達(dá)量最高；在白米株系中，OsCHS、OsCHI、OsF3′H、OsF3′5′H等4個基因在葉中的相對表達(dá)量最高，OsCHI、OsF3H、OsF3′5′H、OsUFGT等4個基因在莖中相對表達(dá)量最高；在紅米株系中，OsPAL、OsCHS、OsCHI、OsF3H、OsDFR、OsF3′5′H、OsUFGT等7個基因在葉中相對表達(dá)量最高，OsPAL、OsCHS、OsCHI、OsF3H、OsANS、OsF3′5′H等6個基因在莖中相對表達(dá)量最高。與其它材料的不同組織花色苷合成結(jié)構(gòu)基因相對表達(dá)量達(dá)極顯著水平，說明花色苷合成結(jié)構(gòu)基因相對表達(dá)量具有組織特異性。

2.3.2花色苷合成結(jié)構(gòu)基因在籽粒發(fā)育過程中的相對表達(dá)量動態(tài)變化

由花色苷合成結(jié)構(gòu)基因相對表達(dá)量測定結(jié)果(表5)看出，在紅米品種貴紅1號中，OsPAL、OsDFR2個基因開始相對表達(dá)量較高，之后逐漸降低，在花后28 d的表達(dá)量最高；OsCHI、OsANS、OsF3′H等3個基因從開花后7～14 d的相對表達(dá)量較低，在21 d出現(xiàn)表達(dá)高峰，之后急劇下降；OsF3H從開花后14 d和28 d出現(xiàn)2個表達(dá)高峰；OsF3′5′H、OsUFGT等2個基因從開花后7～21 d的相對表達(dá)量較高，之后出現(xiàn)大幅度降低的水平；OsCHS從開花后7～28 d的相對表達(dá)量逐漸增加。在白米恢復(fù)系蜀恢498中，OsPAL、OsCHS、OsF3H、OsDFR、OsANS、OsF3′H、OsF3′5′H等7個基因開始的相對表達(dá)量較高，從開花后21 d的相對表達(dá)量最高，之后出現(xiàn)大幅度降低；OsCHI、OsUFGT2個基因從開花后7～14 d出現(xiàn)表達(dá)高峰，之后逐漸降低。在白米株系中，OsPAL開始的相對表達(dá)量較低，之后逐漸升高，從開花后21 d出現(xiàn)表達(dá)高峰，之后逐漸下降；OsCHI、OsF3H、OsANS、OsF3′5′H、OsUFGT等5個基因從開花后7～14 d出現(xiàn)表達(dá)高峰，之后出現(xiàn)較大幅度的降低；其它3個基因的相對表達(dá)量接近0。在紅米株系中，OsPAL、OsCHS、OsCHI、OsF3′5′H、OsUFGT等5個基因從開花后7～28 d的相對表達(dá)量逐漸升高；OsF3H、OsDFR、OsANS等3個基因從開花后7 d的相對表達(dá)量最高，之后出現(xiàn)較大幅度的下降，在28 d出現(xiàn)表達(dá)高峰；OsF3′H開始的相對表達(dá)量較低，在21 d出現(xiàn)表達(dá)高峰，之后急劇降低。

注：1～9從左到右是合成花色苷結(jié)構(gòu)基因在水稻開花后不同取樣時間的相對表達(dá)量。圖2 花色苷合成結(jié)構(gòu)基因在不同材料籽粒發(fā)育過程的相對表達(dá)量動態(tài)變化

結(jié)果表明，參與花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因在4個參試材料中具有不同的表達(dá)模式。紅米品種貴紅1號中的花色苷合成結(jié)構(gòu)基因在中后期的相對表達(dá)量明顯高于白米恢復(fù)系蜀恢498，而前中期的相對表達(dá)量反之；白米株系中OsPAL、OsCHI、OsF3H、OsANS、OsF3′5′H、OsUFGT等5個基因在前中期的相對表達(dá)量明顯高于紅米株系，而中后期花色苷合成結(jié)構(gòu)基因在紅米株系的相對表達(dá)量較高。不同的基因表達(dá)模式可能是4個參試材料顏色差異的原因。

2.3.3花色苷含量與花色苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的相關(guān)性

對4個水稻材料籽粒發(fā)育期內(nèi)花色苷含量與花色苷合成結(jié)構(gòu)基因的相對表達(dá)量進(jìn)行了相關(guān)性分析，OsCHS相對表達(dá)量與花色苷含量相關(guān)系數(shù)分別為0.880、0.929，呈顯著正相關(guān)；在白米株系籽粒發(fā)育過程中，OsF3H表達(dá)量與花色苷含量相關(guān)系數(shù)為0.919，呈顯著正相關(guān)；在紅米株系籽粒發(fā)育過程中，OsPAL表達(dá)量與花色苷含量相對系數(shù)為0.907，呈顯著正相關(guān)，OsCHI、OsF3′5′H和OsUFGT表達(dá)量與花色苷含量相對系數(shù)分別為0.979、0.969、0.975，呈極顯著正相關(guān)。說明OsPAL、OsCHS與紅米品種貴紅1號籽?；ㄉ盏暮铣擅芮邢嚓P(guān)，OsF3H與白米株系籽?；ㄉ蘸铣擅芮邢嚓P(guān)，OsPAL、OsCHI、OsF3′5′H、OsUFGT與紅米株系籽?；ㄉ盏暮铣擅芮邢嚓P(guān)。

3 討論與結(jié)論

花色苷是紅米穎果形成紅色的主要色素之一，花色苷含量差異是紅米材料與白米材料籽粒色澤形成差異的物質(zhì)，合成花色苷結(jié)構(gòu)基因差異表達(dá)與花色苷的積累有一定關(guān)系。在紅米品種貴紅1號中，OsPAL和OsCHS在根、莖和種子均有表達(dá)，而表達(dá)量與Kim等[18]的研究結(jié)構(gòu)相反，是花類黃酮途徑的組成型基因；而OsPAL、OsCHS、OsCHI、OsF3H、OsANS、OsF3′5′H、OsUFGT、OsDFR、OsF3′H從開花后7～28 d都出現(xiàn)早期和晚期2個表達(dá)高峰。研究表明，這些花色苷結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式與總花色苷含量的積累的動態(tài)變化不一樣。水稻果皮和種皮中含有大量的酚類物質(zhì)、花色苷、黃酮類、花青素、原花色素等由類黃酮途徑合成，有一些酶在催化過程中起共同的作用?？赡茉谒竟ず头N皮發(fā)育的早期，這些基因出現(xiàn)表達(dá)高峰且表達(dá)量很高，可能主要參與催化合成黃酮類、酚類物質(zhì)、花青素和原花色素等物質(zhì)，而后期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)高峰則主要是進(jìn)行花色苷的大量合成。

在白米恢復(fù)系蜀恢498中，OsCHI、OsUFGT在莖、葉和種子均有表達(dá)，而其它基因在不同組織器官的表達(dá)量不同，說明基因的表達(dá)具有組織特異性；合成花色苷結(jié)構(gòu)基因在開花后7～28 d的前中期的表達(dá)量較低，后期急劇下降，可能這種表達(dá)模式與果皮和種皮總花色苷含量的變化模式有一定的相似性，這些基因可能參與白米恢復(fù)系蜀恢498的果皮和種皮中花色苷和其它色素的合成。

在白米株系中，OsCHI、OsF3′5′H在莖、葉和種子中均有表達(dá)而表達(dá)量較高，其它的基因在莖、葉和開花后7～28 d種子中不表達(dá)或表達(dá)量不同，說明這些基因的表達(dá)具有組織特異性；而OsPAL、OsCHI、OsF3H、OsANS、OsF3′5′H、OsUFGT在前中期的相對表達(dá)量較低，后期急劇降低，可能這些基因表達(dá)模式與果皮和種皮總花色苷含量的變化模式有一定的相似性，這些基因可能參與白米株系的果皮和種皮中花色苷和其它色素的合成。

在紅米株系中，OsPAL、OsCHS、OsCHI、OsF3H、OsF3′5′H在莖、葉和種子中均有表達(dá)，而其它基因在不同組織的表達(dá)量不同，說明基因的表達(dá)具有組織特異性；合成花色苷的結(jié)構(gòu)基因從開花后7～28 d種子中均有表達(dá)，而OsPAL、OsCHI、OsF3H、OsANS、OsF3′5′H、OsUFGT在中后期的表達(dá)量較高，其它基因在前中期表達(dá)量較高，可能這些基因的表達(dá)模式與果皮和種皮總花色苷含量的變化模式有一定的相似性，這些基因可能參與紅米株系的果皮和種皮中花色苷的大量積累。

通過比較分析發(fā)現(xiàn)，OsPAL、OsCHS在紅米品種貴紅1號和紅米株系的莖、葉和種子均有表達(dá)，OsCHI在白米恢復(fù)系蜀恢498和白米株系的組織中均有表達(dá)，說明這些基因是水稻類黃酮合成途徑的組成型基因；合成花色苷的結(jié)構(gòu)基因在紅米品種貴紅1號和紅米株系開花后7～28 d的前中后期均有表達(dá)，說明這些基因的參與可能與合成大量的花色苷有關(guān)；這些基因在白米恢復(fù)系蜀恢498和白米株系開花后7～28 d的前中期表達(dá)量較低，后期急劇降低，說明這些基因可能參與少量花色苷的合成。

總之，這些基因在紅米材料紅米品種貴紅1號、紅米株系和白米材料白米恢復(fù)系蜀恢498、白米株系的莖、葉和種子開花后7～28 d的前中后期的表達(dá)量具有顯著差異，可能是造成4個參試材料著色差異的主要原因。OsPAL、OsCHS是紅米品種貴紅1號籽?；ㄉ蘸铣傻年P(guān)鍵基因，OsF3H在白米株系籽粒發(fā)育過程中扮演重要的角色，OsPAL、OsCHI、OsF3′5′H、OsUFGT是紅米株系籽粒花色苷的關(guān)鍵基因。

選育優(yōu)質(zhì)花色苷含量高的水稻品種是重要的育種目標(biāo)，本研究以顏色差異較大的親本和它的株系為研究材料，探討了花色苷結(jié)構(gòu)基因在4個材料的差異表達(dá)。由于親本和株系間的遺傳背景有差異，而OsPAL、OsCHS、OsF3H、OsCHI、OsF3′5′H、OsUFGT是否是4個水稻材料花色苷合成的關(guān)鍵基因，以及與花色苷合成調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的互作關(guān)系，還需要進(jìn)一步的研究。