趙娜， 戢楠楠， 蘇文利， 肖少清

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院放療科(海南?？?573011)

乳腺癌仍然是全球女性中最常見的癌癥，盡管近年來女性乳腺癌患者其隨著早期診治及聯(lián)合治療的臨床應(yīng)用其總體的生存率有所提高，但其仍然是多數(shù)女性癌癥患者死亡的主要原因[1]。腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間的相互作用對(duì)于癌癥的發(fā)生和病情進(jìn)展具有重要的作用[2]。越來越多的回顧性和前瞻性研究顯示乳腺癌中高水平的淋巴細(xì)胞浸潤與患者的預(yù)后顯著相關(guān)，特別是三陰性乳腺癌和富含HER2陽性表達(dá)的乳腺癌組織[3]。此外，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)的存在可影響新輔助化療的治療應(yīng)答[4]。因此，了解TIL與乳腺癌臨床特征及對(duì)乳腺癌調(diào)控機(jī)制對(duì)乳腺癌的免疫治療具有重要意義。Wnt通路在不但在腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，同時(shí)也調(diào)控著免疫系統(tǒng)[5]。在外周免疫中，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控成熟T淋巴細(xì)胞的極化，分化和存活[6]。據(jù)報(bào)道，Wnt/β-catenin途徑的激活可能負(fù)向調(diào)節(jié)人T淋巴細(xì)胞中初始效應(yīng)T細(xì)胞的分化[7]。同時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路還抑制樹突細(xì)胞對(duì)Toll樣受體配體誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的樹突狀細(xì)胞(DC)產(chǎn)生，從而重編樹突細(xì)胞導(dǎo)致免疫耐受反應(yīng)[8]。Wnt信號(hào)通常在各種癌癥中被激活[9]，腫瘤細(xì)胞和組織中β-catenin的蓄積通過直接結(jié)合白細(xì)胞介素-10(IL-10)啟動(dòng)子來上調(diào)IL-10的表達(dá)，從而參與腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)控。既往研究在小鼠模型中，Wnt通路的激活阻止了CD8+T細(xì)胞分化成效應(yīng)T細(xì)胞，揭示W(wǎng)nt/β-catenin途徑可能有助于維持成熟CD8+T細(xì)胞的干細(xì)胞性，表明Wnt/β-catenin途徑在用于癌癥的過繼性T細(xì)胞治療中的潛在價(jià)值。據(jù)報(bào)道，高β-catenin活性與乳腺癌預(yù)后不良和腫瘤進(jìn)展相關(guān)[10]。我們之前的研究結(jié)果還表明Wnt/β-catenin途徑在乳腺癌中異常激活，并且可能在該疾病中具有機(jī)械和藥理學(xué)意義。高水平Tregs浸潤的乳腺癌患者其生存率顯著降低[11]，但對(duì)于Treg在乳腺癌組織中的浸潤水平與乳腺癌中β-catenin表達(dá)的關(guān)系仍未明確。因此，本研究旨在探討乳腺癌中Treg的浸潤水平與β-catenin的相關(guān)性及對(duì)患者臨床特征及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2015年2月于我院治療的乳腺癌患者共127例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理確診為乳腺癌；(2)無臨床遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(3)未行新輔助放化療；(4)獲得完整隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病歷資料不完整；(2)失訪的患者；(3)合并機(jī)體免疫性疾病的患者；(4)長期使用類固醇藥物治療的患者；(5)合并多種腫瘤的患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。127例乳腺癌患者，年齡36～68歲，平均(52.3±8.6)歲。

1.2 免疫組化檢測 將選定的甲醛溶液固定石蠟包埋組織塊的以5 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片，切割到固定載玻片上。將組織在二甲苯中脫蠟并再水化。在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)(高壓蒸煮3 min)后，用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。將切片與10%山羊血清一起孵育以減少非特異性結(jié)合和背景染色。優(yōu)化兔單克隆抗體的使用條件，并且以FOXP3(#98377，1∶200稀釋，CST)和β-catenin(#8480，1∶200稀釋，CST)使用抗體，4℃一抗孵育過夜。然后載玻片用含有0.05%Tween的Tris緩沖鹽水洗滌。隨后在室溫下與HRP標(biāo)記的山羊二抗標(biāo)記。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為底物進(jìn)行變色反應(yīng)，然后將載玻片用蘇木精復(fù)染，干燥后使用顯微鏡進(jìn)行鏡下計(jì)數(shù)。

1.3 免疫組化統(tǒng)計(jì) 讓兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理師在高倍鏡下(200×)評(píng)估腫瘤組織中FOXP3+的Tregs浸潤水平,Tregs和β-catenin的評(píng)估均隨機(jī)選擇5個(gè)鏡面評(píng)估后取平均值。根據(jù)Tregs在視野下浸潤的比例，其中Tregs≥20個(gè)/高倍鏡的細(xì)胞比例被認(rèn)為是Tregs高浸潤，<20個(gè)/高倍鏡為Tregs低浸潤。β-catenin的表達(dá)水平通過復(fù)合表達(dá)評(píng)分(composite expression score，CES)進(jìn)行評(píng)估。β-catenin染色的評(píng)估包括染色強(qiáng)度(分類為：0，無染色; 1，弱染色; 2，中等染色; 3，強(qiáng)染色)和陽性癌細(xì)胞的比例(分類為0：<5%; 1：5%～25%; 2：26%～50%; 3：51%～75%;4：76%～100%)。在統(tǒng)計(jì)分析中，將上述兩個(gè)值相乘以獲得CES，基于癌組織的CES，將患者分為兩組，β-catenin低表達(dá)(CES<6)和NAMPT高表達(dá)(CES≥6)。

1.4 臨床資料收集及分析方法 對(duì)比患者的不同年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，人表皮生長因子受體2(HER2)、雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達(dá)的Tregs浸潤情況，分析Tregs浸潤與β-catenin的表達(dá)水平的關(guān)系，記錄所有患者的隨訪的生存情況，對(duì)比不同Tregs浸潤與β-catenin的表達(dá)水平患者的預(yù)后情況。

2 結(jié)果

2.1 Tregs浸潤水平與臨床特征的關(guān)系 127例乳腺癌患者中，Tregs高浸潤的共69例，低浸潤共58例，其中不同年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER2和不同分期的乳腺癌組織中Tregs浸潤水平比例對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而組織分級(jí)為Ⅲ級(jí)的患者乳腺癌組織中Tregs高浸潤水平比例顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)(2=4.806，P=0.028)；ER和PR陰性的Tregs高浸潤水平比例顯著高于ER和PR陽性(2=9.976，P=0.002；2=4.733，P=0.030)，見表1。

表1 乳腺癌組織中Tregs浸潤水平與臨床特征的關(guān)系 例(%)

2.2 Tregs浸潤水平與β-catenin表達(dá)的關(guān)系 127例乳腺癌組織中Tregs浸潤水平與β-catenin表達(dá)的CES評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.677，P<0.001)(圖1)，乳腺癌組織Tregs浸潤與β-catenin表達(dá)見圖2。

圖1 Tregs浸潤水平與β-catenin表達(dá)CES評(píng)分相關(guān)性的散點(diǎn)圖

2.3 Tregs浸潤水平與β-catenin表達(dá)對(duì)乳腺患者預(yù)后的影響 不同的Tregs浸潤水平與β-catenin表達(dá)的總體生存率對(duì)比中，Tregs高浸潤水平合并β-catenin高表達(dá)患者的總體生存率最差，為53.1%，而Tregs低浸潤水平合并β-catenin低表達(dá)總體生存率最好，為87.2%，Tregs高浸潤水平合并β-catenin高表達(dá)患者的總體生存率顯著差于Tregs低浸潤水平合并β-catenin低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=3.770，P<0.001)，見圖3。

A：乳腺癌Tregs高浸潤；B：乳腺癌Tregs低浸潤；C：β-catenin高表達(dá)；D：β-catenin低表達(dá)

圖3 不同Tregs浸潤水平與β-catenin表達(dá)乳腺患者的總體生存率對(duì)比

3 討論

腫瘤微環(huán)境中的TIL主要負(fù)責(zé)腫瘤內(nèi)的免疫應(yīng)答。通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測TIL在腫瘤中的浸潤水平是預(yù)測腫瘤免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)。此外，TIL的存在顯示了患者對(duì)放化療及免疫治療反應(yīng)的預(yù)測作用，并可能有助于臨床醫(yī)生對(duì)腫瘤中免疫細(xì)胞的浸潤水平進(jìn)行評(píng)估以確定患者的預(yù)后情況[12]。其中既往研究已經(jīng)顯示Tregs在對(duì)于乳腺癌的病情進(jìn)展中具有重要作用，但對(duì)于Tregs在乳腺癌中與β-catenin的關(guān)系仍未明確[13]。因此，本研究進(jìn)一步分析了Tregs在乳腺癌中的浸潤水平以及與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。我們的結(jié)果顯示ER/PR狀態(tài)與腫瘤組織Tregs之間存在顯著相關(guān)性。同時(shí)，病理級(jí)別更高的患者其Tregs浸潤水平顯著升高，本結(jié)果部分與國外研究的數(shù)據(jù)相類似[14]，進(jìn)一步研究明確了Tregs浸潤水平與β-catenin表達(dá)呈顯著正相關(guān)，Tregs高浸潤水平與β-catenin高表達(dá)嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后，這顯示了乳腺癌中Tregs浸潤可能參與了β-catenin的調(diào)控，促進(jìn)了腫瘤的病情進(jìn)展。

β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵因子，它主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種的下游基因，并在癌癥中發(fā)揮重要的作用。在沒有Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的情況下，β-catenin被β-catenin破壞復(fù)合物進(jìn)行降解。當(dāng)被Wnt配體激活時(shí)，卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)受體的共激活誘導(dǎo)破壞復(fù)合物的抑制，因此在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定β-catenin。β-catenin最終易位于核內(nèi)，調(diào)節(jié)各種靶基因的表達(dá)[15]。β-catenin在各種惡性腫瘤中積累，這與Wnt/β-catenin途徑在癌變和腫瘤發(fā)展過程中異?；罨嘘P(guān)[16]。既往研究[17]表明，Wnt/β-catenin信號(hào)的改變也存在于超過60%的乳腺癌中，并可預(yù)測患者的不良預(yù)后。越來越多的研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)對(duì)腫瘤免疫系統(tǒng)產(chǎn)生顯著影響。它通過調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞的功能誘導(dǎo)免疫抑制和抵抗[18]。惡性腫瘤中Wnt/β-catenin途徑的失調(diào)可能有助于癌癥免疫逃避和對(duì)免疫療法的抵抗。

在乳腺癌組織中，高水平的CD8+淋巴細(xì)胞浸潤預(yù)示著患者更好的預(yù)后，而高密度的FOXP3+Tregs往往與不良的生存預(yù)后有關(guān)[19]。而Tregs高度浸潤和β-catenin高表達(dá)患者的預(yù)后最差，這些結(jié)果表明Wnt/β-catenin途徑可能在T細(xì)胞功能上起重要的作用。根據(jù)體外模型的結(jié)果，Tregs與靶細(xì)胞接觸后可誘導(dǎo)免疫抑制[20]，但對(duì)于Tregs與Wnt/β-catenin具體的分子機(jī)制，仍需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，乳腺癌中Treg的浸潤水平與ER/PR狀態(tài)及β-catenin的表達(dá)相關(guān)，乳腺癌組織中Tregs高浸潤水平合并β-catenin高表達(dá)是患者預(yù)后的不良的風(fēng)險(xiǎn)因素。