趙素芳， 李冬兵， 孫大勇△

1深圳市第二人民醫(yī)院消化科(廣東深圳 518035)； 2廣州邁景基因醫(yī)學(xué)科技有限公司(廣東廣州 510300)

胃癌嚴(yán)重威脅到人類的身體健康。胃癌是世上第三大常見的腫瘤，全球每年有約一百萬(wàn)人被診斷患有胃癌。2015年，中國(guó)新增癌癥病例約429.2萬(wàn)例，癌癥死亡人數(shù)約281.4萬(wàn)，其中胃癌，在癌癥死亡原因中排在前列[1]。研究表明一線和二線化療對(duì)于晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌患者在生存率方面有一定的益處。胃癌治療的手段有很多，包括手術(shù)治療和藥物治療等。大多數(shù)胃癌在確診時(shí)，屬于部分進(jìn)展或長(zhǎng)遠(yuǎn)轉(zhuǎn)移的晚期患者。這類患者不宜采用手術(shù)治療，最佳治療手段是以全身化療為主的藥物綜合治療，可以延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，同時(shí)提高患者生存質(zhì)量[2]。鹽酸伊立替康是一種DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，可阻斷拓?fù)洚悩?gòu)酶切割復(fù)合物的DNA重新連接[3]。伊立替康的體內(nèi)水解產(chǎn)物為7-乙基-10羥基喜樹堿，研究發(fā)現(xiàn)，與伊立替康自身相比，該水解產(chǎn)物的抗腫瘤活性更高[4]。與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合進(jìn)而阻斷DNA鏈的組裝，引起DNA鏈斷裂，干擾DNA復(fù)制最終發(fā)揮抗腫瘤作用，這是伊立替康及其水解產(chǎn)物的抗腫瘤機(jī)制。伊立替康對(duì)增生的腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷活性在于腫瘤細(xì)胞中DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶含量升高，研究發(fā)現(xiàn)伊立替康具有廣譜抗腫瘤活性，且對(duì)多耐藥腫瘤依然有效[5]。研究發(fā)現(xiàn)單一伊立替康用藥相比于伊立替康聯(lián)合順鉑用藥來(lái)治療胃癌，臨床療效無(wú)顯著性差異，但不良反應(yīng)發(fā)生率明顯降低，結(jié)果表明單一伊立替康用藥方案不良反應(yīng)更小，安全性較高，值得推廣[6]。一些患者在使用伊立替康后產(chǎn)生耐藥。耐藥性的發(fā)展是胃癌治療中的主要障礙。研究發(fā)現(xiàn)伊立替康金屬硫蛋白MT1X的誘導(dǎo)上調(diào)，可能與胃癌患者的伊立替康耐藥有關(guān)[7]。因此，對(duì)于腫瘤耐藥性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)的研究顯得尤為重要，這為解決胃癌耐藥后的進(jìn)一步有效治療提供了一定的依據(jù)?；赗NA-Seq這一高通量測(cè)序方法，能夠有效地獲得目標(biāo)腫瘤組織在特定時(shí)期的幾乎所有基因表達(dá)的信息。這些信息包括部分已知熱點(diǎn)基因的表達(dá)水平的變化和剪接變異，部分稀有基因的表達(dá)水平的變化和剪接變異，部分未知基因的表達(dá)水平的變化和剪接變異。這些信息有利于我們?nèi)娣治霾煌瑯颖局g基因表達(dá)的差異。我們可以采用RNA-Seq來(lái)分析鑒定哪些基因的表達(dá)水平的差異和剪接變異造成了患者的耐藥，篩選這些化療耐藥相關(guān)的基因并深入分析相關(guān)基因的作用機(jī)制，對(duì)于腫瘤患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療中具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入組患者均被診斷為胃低分化腺癌，用藥情況均為伊利替康單藥，這些患者在2015年1月至2017年1月期間使用伊利替康后均產(chǎn)生耐藥?；颊咝彰謩e為SHD、HDL、TYT、WYM、MQ和LCP。SHD：男性，85歲，病理診斷為胃竇粘膜低分化腺癌；HDL：男性，55歲，病理診斷為(全胃)胃低分化腺癌；TYT: 男性，70歲，病理診斷為(胃)低分化腺癌；WYM：女性，50歲，病理診斷為低分化腺癌；MQ：男性，47歲，病理診斷為低分化腺癌；LCP：女性，65歲，病理診斷為中高分化腺癌。入組患者首先均被履行告知義務(wù)，接著簽署知情同意書。按照國(guó)家和國(guó)際倫理學(xué)的有關(guān)要求，對(duì)樣本進(jìn)行收集，包括A組：確診為胃癌患者，伊立替康用藥前樣本(SHD-before、HDL-before、TYT-before、WYM-before、MQ-before和LCP-before)，及B組：確診為胃癌患者，伊立替康用藥后樣本(SHD-after、HDL-after、TYT-after、WYM-after、MQ-after和LCP-after)，樣本均為穿刺組織樣本，用于RNA提取的樣品不低于2 g，至于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩颖卷毾冗M(jìn)行病理切片診斷。

1.2 方法

1.2.1 文庫(kù)構(gòu)建 利用RNA提取試劑盒AllPrep DNA/RNA Mini Kit(QIAGEN，Cat No./ID: 80204)進(jìn)行組織Total RNA的提取，檢測(cè)樣品核酸的濃度；采用RNA建庫(kù)試劑盒 mRNA Hyper Prep Kit(KAPA，KK8580)進(jìn)行高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。具體的操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書；采用Qubit和qPCR對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，判斷文庫(kù)是否符合上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)質(zhì)檢合格的文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 測(cè)序 使用Ⅱlumina測(cè)序平臺(tái)，對(duì)基于耐藥前后的組織構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 差異表達(dá)基因：通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件，獲得耐藥前后組織樣本中基因表達(dá)水平的相關(guān)信息，同時(shí)篩選出耐藥前后組織樣本中的差異表達(dá)基因(FDR<0.05)。腫瘤耐藥的特異差異表達(dá)基因的定義：基于不同患者差異表達(dá)的基因篩選出來(lái)的相同基因。

GO功能和KEGG pathway的富集分析(差異表達(dá)基因)：基于GO FAT 和KEGG pathway進(jìn)行候選基因的功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 原始下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控 基于Genome Analyzer Ⅱx 測(cè)序儀(Ⅱlumina)進(jìn)行RNA-Seq雙端測(cè)序，測(cè)得的原始?jí)A基數(shù)目范圍為62 926 168～109 079 180，見表1。在參考基因組參考序列上，利用軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明所獲得的堿基和參考基因組的匹配度范圍達(dá)88.17%～93.27%，見表1。這些Reads在基因組和轉(zhuǎn)錄組上的分布比較均勻，覆蓋比較完整，見表2、3。這些序列的測(cè)序深度接近50*；說(shuō)明樣品的cDNA文件構(gòu)建比較成功。

2.2 差異表達(dá)基因 本研究采用RNA-seq方法，在耐藥前后的組織樣本中分別檢測(cè)到22 003和21 127表達(dá)基因，所得到的差異基因匯總數(shù)據(jù)見表4、5。其中差異基因數(shù)目為15 970個(gè)基因，達(dá)到顯著差異水平的基因有541個(gè)，達(dá)到極顯著差異水平的基因有148個(gè)。本研究中發(fā)現(xiàn)的541個(gè)突變基因(P值<0.05)與之前的研究結(jié)果進(jìn)行交叉分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABCA3、ADAMTS15、ALMS1、BCL2L11、C1QTNF6、CAPN9、COL12A1、COL5A3、COL7A1、IRF4、KRAS、MPP6、PCDHA1、PIK3CA、POU2AF1、USP13等16個(gè)基因也有發(fā)現(xiàn)。這些基因的變異可以對(duì)患者使用伊立替康藥物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。經(jīng)過(guò)分析可以得到2個(gè)用于顯示兩組樣本數(shù)據(jù)的顯著性差異的因素，一個(gè)因素是樣本間基因表達(dá)的差異倍數(shù)(fold change)，以2為底的對(duì)數(shù)變換；另一個(gè)因素是t檢驗(yàn)所得到的P值，以10為底的對(duì)數(shù)變換。基于2個(gè)因素共同繪制火山圖(圖1)，其中橫坐標(biāo)為差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)為差異的顯著性P值，紅色及藍(lán)色的點(diǎn)均代表差異表達(dá)變化達(dá)到顯著性水平(fold change>1.2倍且P值<0.05)的基因，黑色點(diǎn)代表無(wú)顯著差異表達(dá)變化的基因。通過(guò)進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)SHD-before、HDL-before、TYT-before、WYM-before、MQ-before和LCP-before為一組，SHD-after、HDL-after、TYT-after、WYM-after、MQ-after和LCP-after為一組，這與這些患者的臨床樣本分組結(jié)果是一致的，證明基于這種算法的分組的后續(xù)分析是有意義的。GO功能分析包括生物過(guò)程(biological Process，BP)(圖2)、分子功能(molecular Function，MF)(圖3)和細(xì)胞組分(cellular component，nent，CC)(圖4)?？v坐標(biāo)代表每個(gè)功能分類下的差異基因數(shù)目；條形圖顏色代表富集的GO功能分類的顯著性(P值基于Fisher′s Exact Test計(jì)算得到)，P值的大小與顏色梯度有關(guān)，以藍(lán)色為背景色漸變，越接近深藍(lán)色P值則越小，相對(duì)應(yīng)的KEGG通路富集的顯著性水平越高。通過(guò)GO分析，可以發(fā)現(xiàn)達(dá)到極顯著差異水平的基因有148個(gè)，將這148個(gè)基因按照表達(dá)量的上調(diào)和下調(diào)進(jìn)行了歸類，整理成了表6、7兩組數(shù)據(jù)。我們將得到的差異表達(dá)基因與目前已有的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，最終明確與胃癌患者產(chǎn)生伊立替康耐藥密切相關(guān)的基因包括ABCA3、ADAMTS15、ALMS1、BCL2L11、C1QTNF6、CAPN9、COL12A1、COL5A3、COL7A1、IRF4、KRAS、MPP6、PCDHA1、PIK3CA、POU2AF1和USP13等，可以用于胃癌患者產(chǎn)生伊立替康耐藥機(jī)制的后續(xù)研究。

表1 樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的質(zhì)控統(tǒng)計(jì)表

表2 樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的Genome mapping統(tǒng)計(jì)表

表3 組織樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的Transcriptome Mapping統(tǒng)計(jì)表

圖1 B/A組火山圖

表4 樣本的分組信息及差異基因數(shù)目

表5 差異基因的數(shù)目

圖3 B/A組GO功能富集分析(Cellular Component，CC細(xì)胞組分)

圖4 B/A組GO功能富集分析(Molecular Function，MF分子功能)

2.3 差異表達(dá)的KEGG分析 在生物體內(nèi)，基因不是獨(dú)立地行使各自的功能，而是通過(guò)相互協(xié)調(diào)來(lái)完成一系列生化反應(yīng)并最終產(chǎn)生一系列生物學(xué)功能。KEGG通路分析有助于全面了解腫瘤的異質(zhì)化、發(fā)生及發(fā)展，耐藥的產(chǎn)生機(jī)制等。在進(jìn)行KEGG通路分析時(shí)，基于篩選出來(lái)的差異基因，以KEGG通路為單位，通過(guò)Fisher′s Exact Test，來(lái)分析計(jì)算各個(gè)通路基因富集度的顯著性水平，最終確定表達(dá)水平的變化達(dá)到顯著性差異的代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中，橫坐標(biāo)代表可以顯著富集的KEGG通路；縱坐標(biāo)代表每條KEGG通路中表達(dá)水平達(dá)到顯著性差異的基因數(shù)目；條形圖顏色表示富集的KEGG通路的顯著性差異，P值基于Fisher′s Exact Test計(jì)算得到，P值的大小與顏色梯度有關(guān)，以藍(lán)色為背景色漸變，越接近深藍(lán)色P值則越小，相對(duì)應(yīng)的KEGG通路富集的顯著性水平越高；條形圖上方的數(shù)字代表的是富集因子(rich factor)，富集因子的計(jì)算方法是特定KEGG通路的差異表達(dá)基因數(shù)目與參與該條通路的基因數(shù)目(所有鑒定到的基因)的比例。表8為差異基因的KEGG分析，我們可以看出差異表達(dá)基因的富集通路大多和PI3K-Akt 信號(hào)通路、胃酸分泌、黏附連接、蛋白質(zhì)的消化和吸收、細(xì)胞周期和膽汁分泌等相關(guān)。

表6 耐藥組織及其配對(duì)的用藥前組織的差異表達(dá)基因分析(上調(diào)基因)

表7 耐藥組織及其配對(duì)的用藥前組織的差異表達(dá)基因分析(下調(diào)基因)

3 討論

由于胃癌的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展過(guò)程十分復(fù)雜，單個(gè)或者數(shù)個(gè)基因的研究往往不夠全面；系統(tǒng)的檢測(cè)樣本中基因的表達(dá)改變有助于同步獲取樣本中的表達(dá)譜，篩選出哪些基因發(fā)生了達(dá)到顯著性差異水平的表達(dá)變化，進(jìn)而為尋找與胃癌耐藥相關(guān)的基因、開發(fā)新的藥物作用分子靶點(diǎn)、了解疾病的預(yù)后等提供有利的數(shù)據(jù)信息?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序我們能夠全面地獲取樣本中所有基因的表達(dá)水平的變化及剪接變異的信息，以RNA-Seq為代表的第2代高通量測(cè)序已經(jīng)成為腫瘤相關(guān)研究的重要手段[8-10]。

我們將用藥后組織視為實(shí)驗(yàn)組，與用藥前組織進(jìn)行比較，差異基因表達(dá)的變化與用藥有關(guān)，這些結(jié)果提示在胃癌患者接受化療的過(guò)程中一些基因突變會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥。

本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ξ赴┗颊吣退幗M織及其配對(duì)的用藥前組織進(jìn)行了深度、全面的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從這些差異表達(dá)基因中再篩選出與胃癌密切相關(guān)的基因，共篩選到16個(gè)差異表達(dá)的基因，后續(xù)將會(huì)通過(guò)擴(kuò)大樣本檢測(cè)的方法進(jìn)行鑒定，有望成為診斷胃癌用藥檢測(cè)的分子標(biāo)志物。

圖5 B/A組KEGG通路富集分析

表8 差異表達(dá)基因富集的KEGG通路

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析后，結(jié)果表明差異表達(dá)基因富集在蛋白質(zhì)消化和吸收、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、膽汁分泌、黏附連接、PI3K-Akt 信號(hào)通路、胃酸分泌、細(xì)胞色素 P450代謝和酪氨酸代謝等通路中，這些結(jié)果也暗示這些通路中的差異基因可能在通路之間有crosstalk，最終導(dǎo)致胃癌患者耐藥的產(chǎn)生。

研究發(fā)現(xiàn)MRP基因可能在胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥過(guò)程中起重要作用[11]。在健康人群中，HER-2/NEU處于非激活狀態(tài)，一些致癌因素會(huì)造成其結(jié)構(gòu)的改變或表達(dá)的異常，其表達(dá)進(jìn)而被激活，最終引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[12]。三MMP-9基因(明膠酶B)，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，會(huì)造成腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，機(jī)制是通過(guò)降解基底膜和ECM中的構(gòu)成蛋白來(lái)破壞腫瘤細(xì)胞周圍的ECM[13]。在腫瘤癌癥模型中，伊立替康耐藥伴隨著EGFR和Src信號(hào)傳導(dǎo)的上調(diào)[14]。一項(xiàng)基于胃癌患者腫瘤樣本的研究表明，c-Met受體mRNA表達(dá)水平越高，預(yù)示腫瘤的分化程度越差，導(dǎo)致腫瘤的深度浸潤(rùn)及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[15]。癌癥干細(xì)胞對(duì)伊立替康具有化學(xué)抗性，c-Met抑制劑可能是基于伊立替康的胃癌患者化療的有希望的靶分子[16]。SULF2和WRN甲基化患者對(duì)伊立替康的敏感性也高于其他患者(P<0.05)，SULF2和WRN啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)指示用于鑒定和靶向最敏感的胃癌亞群用于個(gè)性化CPT-11療法的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[17]。GAS通過(guò)降解p27Kip1有助于SGC7901細(xì)胞MDR的出現(xiàn)[18]。

本研究中篩選出的部分差異基因在其他腫瘤研究中有報(bào)道，但這些基因在胃癌研究中尚未見報(bào)道。這些基因在胃癌患者產(chǎn)生伊立替康耐藥過(guò)程中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。