江永祥， 秦冰杰， 張婕， 李余星， 鄭衛(wèi)紅

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國家中藥藥理科研三級實驗室(湖北宜昌 443002)

氯胺酮(ketamine)化學(xué)全名為2-鄰-氯苯基-2-甲氨基環(huán)己酮，分子式為C13H16ClNO，是非競爭性的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，具有良好的鎮(zhèn)痛作用，屬靜脈全麻藥。臨床上主要用于手術(shù)麻醉、小兒檢查或診斷操作時的麻醉誘導(dǎo)及輔助麻醉。由于其具有“致幻性作用”，而在一些娛樂場所被非法濫用[1]。有關(guān)濫用氯胺酮引起的毒性反應(yīng)多有報道，其中氯胺酮的心臟毒性作用受到關(guān)注，臨床有氯胺酮中毒引起心跳呼吸驟停的報道[2]。趙文洲等[3]也報道，氯胺酮可直接損害心肌細胞，造成心肌缺血、心肌酶的釋放，臨床上患者有興奮、心慌、胸悶等癥狀，心電圖檢查發(fā)現(xiàn)有心肌缺血，心肌酶譜(肌酸激酶、肌酸激酶同工酶等)的檢測結(jié)果明顯升高；但有關(guān)氯胺酮中毒后對心功能影響的實驗研究，目前在國內(nèi)外的報道甚少。而近年來，氯胺酮作為新型合成毒品的重要成分，在我國青少年中的濫用愈來愈嚴重，導(dǎo)致了嚴重的公共衛(wèi)生問題，給社會帶來極大危害[4]。當前關(guān)于氯胺酮濫用帶來的危害研究較少，為了闡明氯胺酮中毒后對心功能的影響，為K粉吸食者的法醫(yī)學(xué)鑒定及臨床解救K粉中毒所致心臟毒性提供實驗室數(shù)據(jù)，也為禁用K粉的宣傳教育提供科學(xué)依據(jù)，2015年7月至2017年6月本研究參考預(yù)實驗結(jié)果，采用3個不同劑量的氯胺酮分別灌流大鼠離體心臟，觀察氯氨酮對離體大鼠心臟血流動力學(xué)的改變，探索其心臟毒性，并分析其毒理機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司)；Power Lab離體心臟灌流系統(tǒng)(埃德儀器國際貿(mào)易(上海)有限公司)；SZ-93A自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.2 實驗動物 大鼠為SPF級健康SD大鼠，雌雄各半，體重200～250 g，由三峽大學(xué)實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2011-0061]。

1.3 方法

1.3.1 K-H液的配制 K-H液臨用前以雙蒸水配制，用磁力攪拌器攪拌使全部溶解并混合均勻。K-H液配方(NaCl 6.90 g/L; KCl 0.35 g/L; CaCl20.28 g/L; MgSO4·7H2O 0.30 g/L; KH2PO40.16 g/L; NaHCO32.10 g/L; 葡萄糖1.80 g/L)、混合氣體(95%O2和5%CO2)。用濃度為0.1 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值在7.2～7.4范圍內(nèi)，且連續(xù)2次讀數(shù)差距在±0.02內(nèi)。

1.3.2 離體大鼠心臟Langendorff灌流 取SD大鼠，稱體重，20%烏拉坦0.6 mL/100 g腹腔注射麻醉，固定，腹部作切口，剪開皮膚，沿腹白線開腹至劍突，迅速剪開兩胸側(cè)壁開胸，打開心包膜，暴露心臟，游離主動脈，取出心臟并立即置于預(yù)先用95%O2+5%CO2混合氣體飽和的4℃ K-H液中，漂洗并輕輕擠出心臟中的血液，防止凝血塊形成，然后簡單修剪其周圍組織。開啟Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)，用眼科鑷夾住主動脈斷端，在液體緩慢滴下的同時(防止形成氣栓堵塞冠狀動脈)，將其套入Langendorff灌流裝置中的主動脈插管并以動脈夾固定，然后用絲線結(jié)扎固定，心臟游離后應(yīng)于2 min內(nèi)完成體外灌流操作。

在實驗開始前，將K-H液與含氯胺酮K-H液分別倒入控溫水浴槽的2個缸內(nèi)，打開恒溫浴槽開關(guān)，設(shè)置灌流液溫度維持在(37.0±0.5)℃，給灌注液中持續(xù)通入95% O2+5%CO2混合氣體，打開計算機PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，進行通道設(shè)置、單位轉(zhuǎn)換和調(diào)零，開啟離體心臟Langendorff灌注裝置，流量約20 mL/min，排除管路內(nèi)氣泡。全程記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，并用LabChart分析軟件計算相關(guān)數(shù)據(jù)，再進行數(shù)據(jù)的整理、分析和統(tǒng)計。

1.3.3 心功能的測定 在左心耳處行切口，將測壓導(dǎo)管的球囊經(jīng)切口插入左心室，另一端通過壓力傳感器接入PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)。待心臟搏動穩(wěn)定后，打開三通，向球囊內(nèi)緩緩注入生理鹽水，調(diào)節(jié)球囊的容積，用PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)記錄心室內(nèi)血流動力學(xué)指標的變化，并測定相應(yīng)時間點的左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure， LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)、心率(heart rate，HR)、舒縮時間，同時用量筒測量相應(yīng)時段的冠脈流量(coronary flow，CF)。使左心室的LVEDP在7～10 mmHg范圍內(nèi)，然后關(guān)閉三通保持球囊容積不變并維持整個實驗過程，而后在持續(xù)含氧灌流的情況下，將系統(tǒng)換至恒壓灌流模式，灌注壓保持在55～65 mmHg左右，以CF為5～8 mL/min為宜。

若操作成功，大鼠離體心臟以K-H液灌注平衡30 min后，LVSP>60 mmHg，HR>250次/min，且節(jié)律穩(wěn)定，則視為合格心臟標本(40只，每組10只)進行下一步實驗。

實驗結(jié)束后，根據(jù)系統(tǒng)記錄的心臟舒縮時間，分別計算出心動周期(收縮期+舒張期)中收縮期和舒張期分別占有比例，以了解心臟舒縮功能的變化，計算公式分別為：收縮期比例=收縮期 /(收縮期+舒張期)×100%；舒張期比例=舒張期 /(收縮期+舒張期)×100%。

1.3.4 實驗分組 將40只SD大鼠隨機分為4組(n=10)。(1)對照組：先以K-H液灌注平衡30 min，其余各步以K-H液對照。(2)氯胺酮低劑量組：先以K-H液灌注平衡30 min，再以0.02 mmol/L氯胺酮灌流30 min。(3)氯胺酮中劑量組：先以K-H液灌注平衡30 min，再以0.1 mmol/L氯胺酮灌流30 min。(4)氯胺酮高劑量組：先以K-H液灌注平衡30 min，再以0.5 mmol/L氯胺酮灌流30 min。

2 結(jié)果

K-H液平衡灌注30 min后，各組之間LVSP、LVEDP、±dp/dtmax、舒縮時間及CF差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1～5。

2.1 氯胺酮對大鼠離體心臟LVSP、LVEDP的影響 與對照組相比，氯胺酮高劑量組在灌流5 min后，中劑量組在15 min后，LVSP開始降低(P<0.01，P<0.05)，并隨灌流時間延長差異增大，低劑量組隨灌流時間延長有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而LVEDP則隨氯胺酮濃度的增加和灌流時間的延長逐漸升高(P<0.01)，氯胺酮高劑量組在灌流5 min后，氯胺酮中、低劑量組在10 min后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與給藥前(0 min)比較，也顯示出隨氯胺酮濃度的增加和灌流時間的延長，心臟的LVSP逐漸降低，LVEDP逐漸升高。氯胺酮高劑量組產(chǎn)生顯著性差異的時間最早，氯胺酮中劑量組次之，氯胺酮低劑量組最晚。見表1、2。

表1 氯胺酮對大鼠離體心臟LVSP的影響

與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與0 min比較 △P<0.05，△△P<0.01

表2 氯胺酮對大鼠離體心臟LVEDP的影響

與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與0 min比較 △P<0.05，△△P<0.01

2.2 氯胺酮對大鼠離體心臟±dp/dtmax的影響 與對照組及給藥前相比，氯胺酮高劑量組均在灌注5 min后，中劑量組均在灌注10 min后，心臟的±dp/dtmax開始明顯降低(P<0.01)，并隨灌流時間延長差異增大，氯胺酮低劑量組隨著灌流時間的延長有逐漸降低的趨勢，但僅在灌注30 min后-dp/dtmax的差異才有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

2.3 氯胺酮對大鼠離體心臟CF的影響 與對照組及給藥前相比，氯胺酮高劑量組在灌注5 min后，氯胺酮中劑量組在灌注10 min后，心臟的CF開始明顯減少(P<0.01)，并隨灌流時間延長，差異逐漸加大；氯胺酮低劑量組隨灌流時間的延長，有逐漸減少趨勢，但在觀察的30 min內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

2.4 氯胺酮對離體大鼠心臟HR的影響 與對照組和給藥前比較，氯胺酮中、高劑量組均在給藥5 min后，HR明顯減慢(P<0.01)，并隨灌流時間延長，HR減慢更明顯；氯胺酮低劑量組與對照組比較，隨灌流時間延長，HR有減慢的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與給藥前比較，在給藥10 min后，HR即明顯減慢(P<0.05)。見表5。

2.5 氯胺酮對大鼠離體心臟舒縮時間的影響 與對照組和給藥前比較，隨氯胺酮濃度的增加和灌流時間的延長，心臟收縮期和舒張期均逐漸延長，進一步比較顯示，心動周期中舒張期所占比例逐漸增大，氯胺酮高劑量組在灌流5 min后，氯胺酮中劑量組在10 min后，氯胺酮低劑量組在灌流30 min后差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而收縮期所占的比例則是隨氯胺酮濃度的增加和灌流時間延長逐漸縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，尤其是氯胺酮高劑量組在灌流5 min后，即明顯縮小(P<0.01)。見表6。

表3 氯胺酮對大鼠離體心臟±dp/dtmax的影響

與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與給藥前比較 △P<0.05，△△P<0.01

表4 氯胺酮對離體大鼠心臟CF的影響

與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與給藥前比較 △P<0.05，△△P<0.01

表5 氯胺酮對離體大鼠心臟HR的影響 次/min

與對照組比較 *P<0.05， **P<0.01；與給藥前比較 △P<0.05，△△P<0.01

3 討論

有研究報道[5]，氯胺酮可能通過抑制心肌細胞膜電壓門控鈣通道，抑制Ca2+內(nèi)流，降低細胞內(nèi)靜息Ca2+濃度，而對心肌產(chǎn)生劑量依賴的負性肌力作用。Deng等也報道，大劑量氯胺酮(≥1×10-4mol/L)可呈濃度依賴性抑制心肌細胞膜L-型鈣通道，減少4相鈣內(nèi)流，從而降低竇房結(jié)等慢反應(yīng)自律細胞的興奮性和自律性，表現(xiàn)出竇性心率減慢[6]；另有研究以大鼠心室肌細胞和人離體心房肌單個細胞為模型，采用膜片鉗全細胞記錄方法，從離子通道水平觀測到高濃度氯胺酮還可刺激細胞膜上三磷酸腺苷敏感的鉀通道，促進ATP敏感的鉀通道(IK·ATP)開放，促進鉀外流，增加心肌細胞膜電位水平，從而降低心肌細胞的興奮性[7-8]。還有研究[9]發(fā)現(xiàn)，氯胺酮可抑制大鼠離體心室肌細胞的內(nèi)向整流鉀電流(IK1)，而IK1被認為是決定工作心肌細胞膜靜息電位的主要離子電流，在動作電位3相快速復(fù)極化過程中也起著重要作用，氯胺酮抑制IK1這一外向鉀電流，可抑制細胞膜復(fù)極化，從而延長動作電位時程，導(dǎo)致心率減慢。

氯胺酮可能通過阻滯心肌細胞鈣通道，抑制Ca2+內(nèi)流，降低心肌細胞的收縮性，產(chǎn)生負性肌力作用；同時氯胺酮還可能通過抑制竇房結(jié)的4相鈣內(nèi)流，降低其4相自動除極速率，以及通過激活A(yù)TP敏感的IK·ATP，促進鉀外流，增加心肌細胞膜電位水平，從而降低心肌細胞的興奮性和自律性，而使竇房結(jié)等慢反應(yīng)自律細胞自律性降低，表現(xiàn)出負性頻率作用；由于氯胺酮除了抑制2相Ca2+內(nèi)流外，還可抑制IK1這一外向鉀電流，二者均可導(dǎo)致細胞膜電位的復(fù)極化過程延長，從而延長動作電位的時程。因此，表現(xiàn)為心率減慢，心動周期中舒張期明顯延長，而收縮期相對縮短的改變。

表6 氯胺酮對大鼠離體心臟舒縮時間的影響

與對照組比較 *P<0.05， **P<0.01；與給藥前比較 △P<0.05， △△P<0.01

本研究結(jié)果顯示，氯胺酮可降低大鼠離體心臟的LVSP、±dp/dtmax以及CF(P<0.05)，而升高其LVEDP(P<0.05)，同時明顯減慢HR(P<0.05)，相對縮短其心動周期中的收縮期(P<0.05)，而延長其舒張期(P<0.05)，且隨劑量增加和作用時間延長作用逐漸增強，呈劑量和時間依賴性。提示大劑量氯胺酮可明顯降低心肌收縮力，減慢心率，相對縮短收縮期，延長舒張期，對心臟具有顯著的負性肌力和負性頻率作用，可嚴重抑制心臟的泵血功能。并隨著劑量加大和作用時間延長，抑制作用增強，甚至可以導(dǎo)致心跳停止。由此可以推測，人吸食中毒劑量的“K粉”也可能導(dǎo)致嚴重的心臟抑制作用，產(chǎn)生心臟毒性，過量吸食者可能因劑量過大和搶救不及時而導(dǎo)致嚴重的心率緩慢和心臟泵血功能低下，最終引起心跳停止，而導(dǎo)致死亡。

綜上所述，氯胺酮可抑制心肌收縮力，減慢心率，相對縮短心動周期中的收縮期、延長其舒張期，對心臟功能具有顯著的抑制作用，且呈劑量和時間依賴性。