劉曉龍, 張雅敏△, 許洋

天津市第一中心醫(yī)院移植中心 1肝膽外科； 2腎移植科(天津 300192)； 2天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院(天津 300000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的癌癥之一，是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而預(yù)后較差[1]。雖然過去幾十年來HCC的治療取得了很大進(jìn)展，但5年生存率仍然很低[2]。因此，研究HCC的分子機(jī)制可能為肝癌治療提供新的靶點(diǎn)。miRNA是小的非編碼RNA，其通過結(jié)合靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)來抑制翻譯或誘導(dǎo)mRNA降解來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)[3]。研究表明，miRNA的失調(diào)參與了多種癌癥的發(fā)病和進(jìn)展，如HCC、結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌[4]。miRNA在肝癌的生物學(xué)過程中起重要作用，可以通過多種機(jī)制調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和新生血管生成[5]。多組研究發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p在乳腺癌、肝癌、軟骨肉瘤等多種惡性腫瘤的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[6-8]。miR-16-5p可通過多種調(diào)控通路發(fā)揮促癌和抑癌的作用[9]。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶3(AKT3)與細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡等息息相關(guān)，是多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程的重要調(diào)節(jié)因子[10]。而在當(dāng)前的研究中，對于miR-16-5p調(diào)控AKT3在肝細(xì)胞癌中的作用的研究較少，2017年6月至2018年6月，本研究通過在人肝癌組織和肝癌細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中AKT3為miR-16-5p的直接調(diào)控靶點(diǎn)，miR-16-5p能靶向調(diào)控AKT3，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌標(biāo)本和癌旁正常肝組織(38例，37～72歲，男28例,女10例)，取材于天津市第一中心醫(yī)院肝膽外科。血清于美國Gbico公司采購。SMMC-7721肝癌細(xì)胞系于上海中科院細(xì)胞庫采購。qRT-PCR試劑盒購于美國Bio-Rad公司。兔抗鼠AKT3、N-Cadherin、Snail、Vimentin和GAPDH抗體，以及羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購于英國Abcam公司。miR-16-5p mimic和AKT3干擾RNA購于廣州銳博公司。CCK-8試劑盒購于日本同仁公司。Transwell小室購于德國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 病理組織分為肝癌組織組和癌旁正常肝組織組，肝癌組織又分為miR-16-5p(H)(miR-16-5p高表達(dá)組)和miR-16-5p(L)(miR-16-5p低表達(dá)組)；將SMMC-7721肝癌細(xì)胞分為3組，分別為NC組(空白對照)、mimic組(轉(zhuǎn)染miR-16-5p激動(dòng)劑mimic)和mimic+SiRNA組(轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic后轉(zhuǎn)染SiRNA AKT3以敲除AKT3)。

1.3 qRT-PCR測定正常肝和肝癌組織中miR-16-5p含量 對正常和肝癌組織經(jīng)過Trizol法提總RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA、加入特定的前后引物，經(jīng)變性、退火、延伸后，對結(jié)果使用比較閾值法進(jìn)行定量分析，其計(jì)算方法是：目的基因定量拷貝數(shù)=2-ΔΔCt，ΔCt對照組=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組，對每一分組計(jì)算目的基因拷貝數(shù)。

1.4 免疫組化染色 肝癌組織脫水后包埋蠟塊，切片，常規(guī)二甲苯、梯度酒精脫水，H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，5%山羊血清封閉1 h，敷一抗4℃冰箱濕盒過夜，敷二抗，DAB顯色，蘇木染色，封片后顯微鏡下觀察。細(xì)胞免疫組化同組織一樣進(jìn)行脫水、去除內(nèi)源性過氧化物酶、封閉、敷一抗、敷二抗、DAB顯色、蘇木染色，顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，觀察并計(jì)算陽性細(xì)胞比例。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SMMC-7721肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后置于5%培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞密度為70%左右。在6孔板每孔加入10 μL/孔的轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000分別與miRNA和siRNA進(jìn)行整合，然后加入到6孔板中。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～6 h后更換10%新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)至密度為80%左右時(shí)，胰酶消化、重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入6孔板。培養(yǎng)2周，當(dāng)有肉眼可見明顯的細(xì)胞集落時(shí)終止培養(yǎng)， 0.5%結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)每孔的克隆數(shù)。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測肝癌侵襲和遷移能力 細(xì)胞密度培養(yǎng)至80%左右時(shí)，消化、重懸，加入到24孔板中。將Transwell小室(分為加Matrigel膠和不加Matrigel膠)放入24孔板內(nèi)，小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液。CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24～48 h后棄去培養(yǎng)基，取出小室，用0.1%結(jié)晶紫染液室溫染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.8 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力 用CCK-8試劑盒分別檢測各組肝癌細(xì)胞在0、30、60、90和120 h的活性細(xì)胞數(shù)量。

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測蛋白表達(dá)情況 各組細(xì)胞加入裂解液、取上清，BCA法蛋白定量，蛋白變性后每組取50 μg/孔行凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，敷一抗(兔抗鼠AKT3、N-cadherin、Snail、Vimentin、ZO-1與GAPDH，1∶1 000)，4℃搖床過夜，TBST洗3遍后室溫下敷羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5 000)1 h，均勻加入發(fā)光液與PVDF膜反應(yīng)后曝光，條帶使用Image J軟件檢測灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)、2檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-16-5p與AKT3基因相關(guān)性 Targetscan預(yù)測顯示miR-16-5p(3′-GCGGUUAUAAAUGCACGACGAU-5′)與AKT3(5′-AGGUCUCAUGCUGUUGCUGCUA-3′)部分片段能堿基互補(bǔ)配對，說明具有高度相關(guān)性。見圖1。

圖1 Targetscan預(yù)測miR-16-5p與AKT3基因相關(guān)性

2.2 miR-16-5p在人肝癌組織中低表達(dá) 利用qRT-PCR檢測肝癌組織和癌旁正常肝組織中miR-16-5p和AKT3表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：在人肝癌組織(6.45±0.68)中miR-16-5p低表達(dá)，而在癌旁正常肝組織(11.48±0.61)中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.496,P<0.05)；AKT3在肝癌組織(13.67±0.71)中表達(dá)量高，而在癌旁正常肝組織(8.01±0.48)中表達(dá)量低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.602,P<0.05)；miR-16-5p與AKT3在肝癌組織中表達(dá)情況高度負(fù)性相關(guān)(r=-0.903 8,P<0.05)。見圖2-A、B、C。對miR-16-5p高表達(dá)和低表達(dá)肝癌組織進(jìn)行免疫組化檢測AKT3表達(dá)情況可見：miR-16-5p高表達(dá)肝癌組織中AKT3表達(dá)量低，而miR-16-5p低表達(dá)肝癌組織中AKT3表達(dá)量高。見圖2-D、E。

A: miR-16-5p在肝癌組織和正常肝組織中含量;B:AKT3在肝癌組織和正常肝組織中含量;C: miR-16-5p和AKT3之間的相關(guān)性;D:免疫組化染色檢測miR-16-5p高表達(dá)肝癌組織中AKT3表達(dá)分布情況(×200);E:免疫組化染色檢測miR-16-5p低表達(dá)肝癌組織中AKT3表達(dá)分布情況(×200)

2.3 miR-16-5p負(fù)性調(diào)控AKT3 qRT-PCR檢測顯示mimic組(10.92±0.48)miR-16-5p含量較NC組(4.76±0.49)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.837,P<0.05)；而對于AKT3表達(dá)量,mimic組(4.49±0.56)較NC組(8.41±0.60)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.738,P<0.05)。免疫組化染色結(jié)果顯示mimic組(0.288±0.027)AKT3表達(dá)量較NC組(0.848±0.025)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=124.7，P<0.05)。見圖3-C。Western blot檢測顯示AKT3蛋白表達(dá)量mimic組(0.40±0.03)較NC組(0.63±0.07)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.16，P<0.05)。見圖3-D。說明miR-16-5p通過負(fù)向調(diào)控AKT3在肝癌細(xì)胞中產(chǎn)生作用。

2.4 miR-16-5p過表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá) Transwell結(jié)果發(fā)現(xiàn)：mimic組(140.5±5.99)使miR-16-5p過表達(dá)后可使肝癌細(xì)胞的侵襲能力較NC組(191.2±7.79)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.16,P<0.05)(見圖4-A、B)；mimic組(154.2±7.53)肝癌細(xì)胞遷移能力較NC組(264.8±7.04)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.72,P<0.05)。見圖4-C、D，說明miR-16-5p過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。Western blot結(jié)果顯示mimic組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)量較NC組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、表1。

A:qRT-PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-16-5p含量;B:qRT-PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后AKT3含量;C:Western blot檢測AKT3蛋白表達(dá)量;D:免疫組化染色檢測NC組細(xì)胞內(nèi)AKT3表達(dá)分布情況；E:免疫組化染色檢測mimic組細(xì)胞內(nèi)AKT3表達(dá)分布情況；F:統(tǒng)計(jì)分析NC組和mimic組AKT3表達(dá)陽性細(xì)胞比例

A:Transwell檢測肝癌細(xì)胞侵襲變化情況;B：肝癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù); C:Transwell檢測肝癌細(xì)胞遷移變化情況;D:肝癌細(xì)胞遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖5 Western blot檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表1 Western blot檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)情況(條帶灰度值檢測結(jié)果)

2.5 miR-16-5p通過靶向調(diào)控AKT3抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移 平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示mimic組(291.9±8.76)較NC組(481.2±8.32)肝癌細(xì)胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.66，P<0.05)；mimic+siRNA組(65.6±6.10)較mimic組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.18，P<0.05)；mimic+siRNA組(65.6±6.10)較NC組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.25，P<0.05)。CCK-8檢測顯示mimic組較NC組肝癌細(xì)胞活性降低(F=205.0,P<0.05)，mimic+siRNA組較mimic組和NC組均明顯降低(F=152.9,F=76.8,P<0.05)。Western blot檢測顯示mimic組較NC組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白N-Cadherin和Snail表達(dá)量較低，mimic+siRNA組N-Cadherin和Snail表達(dá)量較mimic組和NC組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6-D、表2。說明miR-16-5p通過靶向調(diào)控AKT3抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。見圖6。

A:平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞增殖能力;B:平板克隆細(xì)胞集落計(jì)數(shù)(個(gè)/孔);C:CCK-8檢測肝癌細(xì)胞活性變化;D:Western blot檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表2 Western blot檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)情況(條帶灰度值檢測結(jié)果)

3 討論

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在全球肝癌每年的發(fā)病人數(shù)超過5 000萬，盡管目前醫(yī)學(xué)上對肝癌的研究比較成熟，但肝癌患者5年生存率只有5%～9%[11]。近些年研究發(fā)現(xiàn)miRNA是重要的抑癌因子，尤其在調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等方面具有重要作用[12]。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-16-5p在肝癌組織中明顯下調(diào)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-16-5p特別是miR-16家族在多種類型的腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，如胃癌[13]、乳腺癌[14]和宮頸癌[15]。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p在肝癌組織中具有與其他類型癌癥類似的下調(diào)表達(dá)譜。

本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)miR-16-5p過表達(dá)可通過降低肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生抗癌作用。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-16-5p和miR-19b-3p在胃癌組織中下調(diào)，兩種miRNA在血漿中的含量能夠診斷胃癌，并且能對不同TNM分期和分化程度進(jìn)行鑒別，尤其適用于早期胃癌。Liang等[14]報(bào)道了在乳腺癌、肺癌和肝癌細(xì)胞中，miR-16通過FEAT靶向調(diào)控以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。Zubillaga-Guerrero等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-16-1在宮頸癌細(xì)胞中能通過靶向調(diào)控CCNE1進(jìn)而影響細(xì)胞周期，最終干預(yù)宮頸癌的疾病過程。本研究中，我們通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染促進(jìn)miR-16-5p過表達(dá)，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)miR-16-5p過表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞SMMC-7721的侵襲性和遷移性，但其具體調(diào)控方式仍需探索。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-16-5p能靶向調(diào)控AKT3產(chǎn)生抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，AKT3在多種類型癌癥中參與調(diào)控作用。Chin等[16]報(bào)道了AKT3表達(dá)下調(diào)能通過p27對三陰乳腺癌的細(xì)胞周期產(chǎn)生抑制作用，靶向下調(diào)AKT3及其下游信號可能是抑制三陰乳腺癌生長的有效方法。Joy等[17]研究發(fā)現(xiàn)AKT3能延緩惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、分化，延緩腫瘤進(jìn)展。Kim等[18]通過對人膀胱癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中AKT進(jìn)行特異性敲除，探討了AKT在線粒體功能調(diào)節(jié)中的作用，發(fā)現(xiàn)AKT1和AKT3的敲除誘導(dǎo)了人膀胱癌細(xì)胞線粒體的顯著增加，AKT3敲除導(dǎo)致最嚴(yán)重的線粒體功能障礙，這表明不同的AKT3在維持人類癌細(xì)胞中線粒體功能方面發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們通過使用特定的干擾RNA敲除AKT3，發(fā)現(xiàn)敲除AKT3后肝癌細(xì)胞活性、增殖能力明顯降低，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)記蛋白N-Cadherin和Snail表達(dá)降低，說明抑制AKT3表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的抑癌作用。

研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與調(diào)控AKT3產(chǎn)生抗腫瘤作用。Yang等[19]報(bào)道了miR-424直接靶向調(diào)控AKT3和E2F3進(jìn)而抑制細(xì)胞周期和E2F通路，最終抑制肝癌細(xì)胞生長。有研究發(fā)現(xiàn)miR-144與AKT3的3′-UTR結(jié)合，肝癌細(xì)胞中miR-144的過度表達(dá)降低AKT3表達(dá)水平，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖、侵襲 和遷移受到抑制，說明AKT3的異位過表達(dá)能夠減弱由miR-144過表達(dá)誘導(dǎo)的腫瘤抑制特征，表明miR-144通過靶向調(diào)控AKT3介導(dǎo)在肝癌中的抗腫瘤作用[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-16-5p能夠特異性調(diào)控AKT3，抑制肝癌細(xì)胞增殖活性、侵襲和遷移能力。miR-16-5p靶向調(diào)控AKT3產(chǎn)生的抑癌作用為臨床診斷、評估和治療肝癌提供了新思路。