郭莉， 李建東， 郭珊珊， 陳航， 龔幼蘭， 張亞璞

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院 腎臟內(nèi)科， 河北 保定 071000)

慢性炎癥引起的終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)極易引發(fā)血管鈣化和動脈粥樣硬化等并發(fā)癥[1]，鈣磷代謝紊亂是血管硬化的常見危險因素之一，而高磷血癥又是血管鈣化的重要誘因[2]。Klotho蛋白是一種骨-腎內(nèi)分泌軸蛋白，與衰老密切相關(guān)，主要在腎臟表達(dá)，正常生理情況下Klotho蛋白參與維持機(jī)體磷和維生素D的平衡[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腎功能出現(xiàn)下降時，Klotho蛋白表達(dá)減少[5]，而Klotho蛋白的缺乏有可能會導(dǎo)致血管鈣化[6]。ESRD患者體內(nèi)常常伴隨有炎癥的發(fā)生[7-8]，關(guān)于ESRD患者炎癥狀態(tài)與Klotho蛋白表達(dá)是否有關(guān)的報道較少，本研究通過檢測ESRD大鼠炎癥狀態(tài)時的多項(xiàng)血管鈣化指標(biāo)，探討Klotho蛋白與炎癥狀態(tài)下ESRD大鼠血管鈣化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器及動物

1.1.1主要試劑及儀器 腺嘌呤、酪蛋白購自邁新生物技術(shù)有限公司，血清鈣(Ca)、磷(P)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)試劑盒購自北京北方生物研究所，Klotho蛋白、大鼠丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)及甲狀旁腺激素(iPTH) ELISA試劑盒購自美國Sigma公司，大鼠Klotho免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物 SPF級成年健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量250 g，由中國食品藥品檢定研究院提供[許可證號SCXK(京)2016-0017]。實(shí)驗(yàn)的整個過程對SD大鼠處置均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，參考文獻(xiàn)[9-10]將大鼠隨機(jī)分均為對照組(灌胃生理鹽水)、ESRD組(灌胃250 mg/kg腺嘌呤)、ESRD合并炎癥組(灌胃250 mg/kg腺嘌呤，隔日以1.0 g/kg皮下注射10%酪蛋白)，各組大鼠連續(xù)灌胃10周。

1.3 檢測指標(biāo)

連續(xù)灌胃10周后，禁食12 h后稱重，按0.3 mL/100 g體質(zhì)量給予10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉后各組大鼠通過腹主動脈收集血液，3 000 r/min離心分離血清，采用化學(xué)比色法檢測血清Ca、P、BUN及SCr，采用ELISA法檢測血清iPTH水平；取血麻醉后處死大鼠，取大鼠腎臟組織，去除腎臟包膜，縱切面切開腎臟，1/3置于4%多聚甲醛固定，其余-80 ℃冰箱凍存。多聚甲醛固定的腎臟組織石蠟包埋、切片，采用免疫組化法檢測Klotho蛋白在腎臟組織的原位表達(dá)，HE染色后顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變，茜素紅染色后顯微鏡下觀察腎組織鈣鹽沉積。取-80 ℃凍存的腎組織塊置于研缽內(nèi)，用移液器按1 ∶9的比例取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.9%氯化鈉)在冰上碾磨6～8 min，充分碾碎，使組織勻漿化，低溫低速3 000 r/min，離心15 min，離心好的勻漿留取上清液，采用ELISA法測定腎組織勻漿上清液中Klotho蛋白水平、MDA及CAT含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清P、Ca、SCr、BUN及iPTH

灌胃10周時， ESRD組、ESRD合并炎癥組大鼠血清P、SCr、BUN及iPTH濃度顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；ESRD組與ESRD合并炎癥組血清P、SCr、BUN及iPTH濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組大鼠血清Ca濃度比較，ESRD組

2.2 腎組織勻漿中Klotho蛋白、MDA及CAT水平

大鼠腎臟組織勻漿中Klotho蛋白和CAT水平表現(xiàn)為ESRD合并炎癥組ESRD組>對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

血清指標(biāo)對照組ESRD組ESRD合并炎癥組P(mmol/L)2.02±0.115.21±0.35(1)5.36±0.29(1)Ca(mmol/L)2.66±0.232.14±0.15(2) 2.47±0.32(2) (3)SCr(μmol/L)63.47±5.93268.91±10.55(1)260.73±11.98(1)BUN(mmol/L)7.18±0.9227.44±2.51(1)34.19±3.75(1)iPTH(ng/L)30.42±4.2843.61±5.90(1)45.49±4.86(1)

注：與對照組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05；(3)與ESRD組比較，P<0.05。

表2 各組大鼠腎臟組織勻漿中Klotho蛋白表達(dá)水平、MDA及CAT含量比較Tab.2 Comparison of Klotho protein expression, MDA and CAT content in renal homogenate of rats in each group

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與ESRD組比較，P<0.05。

2.3 腎組織Klotho蛋白表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，Klotho蛋白表達(dá)主要集中在腎小管，正常對照組Klotho蛋白表達(dá)較多，ESRD組和ESRD合并炎癥組Klotho蛋白的表達(dá)減少，ESRD合并炎癥組表達(dá)最弱，ESRD組、ESRD合并炎癥組顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表3。

2.4 腎臟組織組織形態(tài)學(xué)

HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腎小球、小管間質(zhì)、腎血管均正常，而ESRD組呈現(xiàn)系膜區(qū)增寬，腎小球、腎小管纖維結(jié)締組織增生顯著，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，ESRD合并炎癥組出現(xiàn)腎小球萎縮和硬化。見圖1。

表3 各組大鼠腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression of Klotho protein in kidney of rats in each group

注：(1)與對照組比較，P<0.05。

2.5 大鼠腎組織鈣鹽沉積

茜素紅染色結(jié)果顯示，正常對照組無鈣化，ESRD組腎內(nèi)小動脈及周圍組織有少許點(diǎn)片狀鈣鹽沉積，而ESRD合并炎癥組腎內(nèi)小動脈及周圍組織有較多紅色點(diǎn)片狀鈣鹽沉積，腎內(nèi)小動脈存在明顯鈣化現(xiàn)象。見圖1。

注：A、B、C為Klotho蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200，箭頭為表達(dá)陽性)，D、E、F為組織形態(tài)學(xué)(HE，×200，箭頭為系膜區(qū)增寬)，G、H、I為鈣鹽沉積(茜素紅，×400，紅色示鈣鹽沉積)。圖1 各組大鼠腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)、組織形態(tài)學(xué)及鈣鹽沉積Fig.1 Expression of Klotho protein in kidney tissue of rats in each group

3 討論

血管鈣化是一種常見、發(fā)生于血管系統(tǒng)軟組織的生物鈣化，磷酸鈣礦物質(zhì)在各種血管組織中的沉積是其典型表現(xiàn)，可導(dǎo)致血管中層厚度增加或硬化斑塊的形成，臨床多見于老齡、高血壓、腎功能不全者等[11-13]。本課題組已報道，ESRD患者高磷血癥與血管硬化密切相關(guān)，血磷水平是影響患者血管情況的重要因素。本研究觀察了血清Ca、P、SCr、BUN及iPTH的水平，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，ESRD組、ESRD合并炎癥組大鼠血清Ca均降低，而血清P和iPTH卻顯著升高。提示ESRD時大鼠腎功能減退，限制機(jī)體對鈣的吸收，進(jìn)而引起血清中低血鈣的發(fā)生；但由于腎功能障礙，導(dǎo)致腎臟排泄磷的能力的減弱，所以會引起大鼠血清P水平的升高；而低鈣高磷血癥又對iPTH的分泌產(chǎn)生刺激，加劇iPTH水平的上升。因此，抑制甲狀旁腺功能亢進(jìn)或iPTH的分泌也可成為臨床防治血管鈣化的有效措施之一。

Klotho蛋白與多種生物學(xué)功能相關(guān)，在腎病發(fā)生、發(fā)展過程中起到關(guān)鍵性作用[14]。有研究表明：Klotho基因的表達(dá)多少與腎衰竭的發(fā)生密切有關(guān)，過表達(dá)可減輕腎臟氧化應(yīng)激造成的損傷，對腎臟產(chǎn)生一定的保護(hù)作用[15]；而ESRD患者體內(nèi)常常伴有炎癥的發(fā)生，CAT是一類末端氧化酶，為生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，可防止細(xì)胞內(nèi)過氧化；MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度，二者可以反映慢性腎臟病患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平[16]。本研究檢測炎癥狀態(tài)下ESRD大鼠的Klotho蛋白濃度、CAT含量、MDA含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對照組大鼠腎組織中CAT含量較高，而ESRD組與ESRD合并炎癥組大鼠CAT含量均顯著下降(P<0.01)；與對照組比，ESRD組與ESRD合并炎癥組大鼠MDA顯著升高(P<0.01)；免疫組化染色Klotho蛋白表達(dá)主要集中在腎小管，ESRD組和ESRD合并炎癥組Klotho蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，且ESRD合并炎癥組大鼠的表達(dá)最弱；提示ESRD患者在炎癥狀態(tài)時，Klotho蛋白減少與CAT含量下降、MDA含量升高有關(guān)，推測Klotho蛋白可能通過防止細(xì)胞內(nèi)過氧化和避免細(xì)胞受自由基攻擊來保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，從而在ESRD時保護(hù)組織免受炎癥的傷害。 HE染色結(jié)果提示：對照組大鼠腎小球、小管間質(zhì)、腎血管均正常，而ESRD組呈現(xiàn)系膜區(qū)增寬，腎小球、腎小管纖維結(jié)締組織增生顯著，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，ESRD合并炎癥組出現(xiàn)腎小球萎縮和硬化；茜素紅染色顯微結(jié)果顯示：ESRD組腎內(nèi)小動脈及周圍組織有少許點(diǎn)片狀鈣鹽沉積，而ESRD合并炎癥組腎內(nèi)小動脈及周圍組織有較多紅色點(diǎn)片狀鈣鹽沉積，腎內(nèi)小動脈存在明顯鈣化現(xiàn)象。上述結(jié)果提示在ESRD時，炎癥可作為一種危險因素促進(jìn)血管鈣化，與Klotho蛋白下降有關(guān)。有體外實(shí)驗(yàn)證明，Klotho蛋白能直接抑制磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化，阻礙血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[17]。推測Klotho蛋白可能是血管鈣化的抑制因子，機(jī)制可能為：(1)Klotho蛋白通過加強(qiáng)FGF-23活性促進(jìn)腎臟磷的排泄；(2)過表達(dá)Klotho可延緩CRF進(jìn)展，阻礙由于腎功能惡化導(dǎo)致的礦物質(zhì)代謝紊亂和其他血管鈣化的因素[18]。Hu等[19]研究顯示：KLotho過表達(dá)的CKD基因小鼠具有較高的Klotho蛋白水平，且小鼠有較好的殘存腎功能。

綜上所述，甲狀旁腺功能亢進(jìn)和鈣磷代謝紊亂可以啟動血管鈣化。炎癥狀態(tài)可加速ESRD血管鈣化的進(jìn)程，而Klotho 蛋白對ESRD血管具有一定的保護(hù)作用，可改善高磷血癥以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，具有重要的臨床參考價值。