秦起， 李芮， 曾慶繁 ***

(1.貴州醫(yī)科大學 麻醉學院， 貴州 貴陽 550004； 2.十堰市太和醫(yī)院 麻醉科, 湖北 十堰 442000)

腦缺血再灌注損傷是腦組織在缺血一定時間的基礎上恢復血流后損傷加重、甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象，近年來對其損傷機制及藥物保護的研究已取得進展[1-3]。七氟醚是臨床常用的吸入麻醉藥，研究表明七氟醚預處理可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷，但是具體機制尚不清楚[4-6]。文獻報道腦內分布有血管緊張素Ⅱ-2受體(Angiotensin Ⅱ-2 Receptor，AT2R)，AT2R激活后可以通過改善血液灌注、抗炎、神經(jīng)恢復及再生等過程來保護腦組織[7-8]。本研究擬探討七氟醚預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用是否與激活腦AT2R及抗炎作用有關，報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

七氟醚(批號79111，美國艾伯維公司)，AT2R拮抗劑PD123319(美國MCE公司)，線栓(北京西濃科技有限公司)，TTC (美國Sigma公司)，AT2R抗體(美國abcam公司)，GAPDH單克隆抗體(美國Proteintech公司)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體(美國Proteintech公司)，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(上海欣博盛科技有限公司)，BCA蛋白測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。麻醉呼吸機及麻醉氣體監(jiān)測儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.2 動物分組與處理

8～10周齡、體質量260～280 g的健康雄性SD大鼠80只，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供[許可證號SCXK(黔)2018-001]，隨機均分成假手術組(Sham組)、腦缺血再灌注損傷組(IR組)、七氟醚+腦缺血再灌注損傷組(SP組)、AT2R拮抗劑+七氟醚+腦缺血再灌注損傷組(SPD組)及AT2R拮抗劑+腦缺血再灌注損傷組(PD組)。5組大鼠給予2.5%七氟醚和2 L/min的氧氣吸入麻醉1 h、連續(xù)5 d，SPD組和PD組同時分別注射腹腔注射AT2R阻斷劑1 mL (1 mg/kg)、5 d，其余3組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水；最后一天(第5天)麻醉和給藥后24 h，IR組、SP組、SPD組及PD組大鼠制作腦缺血再灌注損傷模型，Sham組大鼠只分離頸總動脈不接扎。

1.3 七氟醚預處理

將需要麻醉的SP組、SPD組大鼠置于透明的密閉塑料麻醉箱(50 cm×30 cm×30 cm)，箱底鋪一層鈉石灰,將取暖器置于箱旁60 cm，維持鼠肛溫36～37 ℃。進氣口吸入2.5 %的七氟醚和2 L/min的氧氣1 h/d、連續(xù)5 d。出氣口接麻醉氣體監(jiān)測儀和廢氣回收罐,檢測七氟醚、CO2及O2濃度,其它組在相應時間只吸入2 L/min的氧氣,直至麻醉結束。麻醉過程中保持自主呼吸,密切觀察監(jiān)護儀及鼠皮膚顏色和呼吸幅度，麻醉結束后待大鼠自然清醒后放回鼠籠中。

1.4 腦缺血再灌注損傷模型制備

參照Longa等[9-10]改良的使用線栓阻塞大腦中動脈的方法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。10%的水合氯醛 (350 mg/kg) 腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥固定、消毒，右側頸部旁正中縱行切口，依次分離出頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，縫線結扎頸外動脈和頸總動脈，動脈夾臨時夾閉頸內動脈的遠心端后，離頸外動脈與頸內動脈分叉處5 mm處作一切口，從切口處向頸內動脈插入線栓，輕微的突破感為止(18 mm左右)，線栓固定后縫合傷口，實施大腦中動脈阻塞導致腦缺血，2 h后稍微向外拔出線栓實施再灌注。

1.5 觀察指標

1.5.1神經(jīng)功能缺損評分(NDS評分) 參照Longa神經(jīng)評分法，在局灶性腦缺血-再灌注24 h后，對實驗大鼠進行神經(jīng)行為學測試評分。NDS評分標準如下：無神經(jīng)功能缺損計0分，輕度神經(jīng)功能缺損(不能完全伸展對側前肢)計1分,中度神經(jīng)功能缺損(向對側轉圈)計2分,重度神經(jīng)功能缺損(向對側傾倒)計3分，不能自發(fā)行走，意識水平降低計4分。

1.5.2腦梗死體積測定 大鼠再灌注24 h后，各組隨機選取5只。水合氯醛麻醉后迅速處死斷頭冰上取腦,置于-20 ℃冰箱20 min后切除額極與枕極,沿冠狀面均勻切5片，置于2%的TTC染色液中，37 ℃溫箱避光孵育30 min，中間每隔5 min輕輕翻動腦片，使其均勻著色，4%多聚甲醛4 ℃冰箱固定24 h。數(shù)碼相機拍照照片輸入Image-ProPlus6.0圖像分析軟件測梗死體積，各腦片梗死體積之和乘以厚度(2 mm)即為梗死體積，以梗死體積占全腦體積百分比反映腦梗死體積。

1.5.3AT2R蛋白含量測定 再灌注24 h后，水合氯醛麻醉后迅速斷頭處死冰上剝離海馬組織,從海馬組織中提取蛋白質，BCA法測蛋白濃度后，用PBS調整蛋白樣品濃度與上樣緩沖液等體積混合，100 ℃煮沸10 min，冷卻后用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白質進行分離，并將分離后的蛋白質轉移到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。加入AT2R(1 ∶2 000)和 GAPDH (1 ∶5 000)抗體,4 ℃孵育過夜。TBST清洗膜后加入二抗(1 ∶5 000)進行孵育。ECL顯色后圖片輸入Image-ProPlus6.0圖像分析軟件。采用AT2R與內參GAPDH的灰度值的比值來反映AT2R含量。

1.5.4海馬組織炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量測定 從-80 ℃冰箱取出新鮮海馬組織標本，剪碎后加適量PBS(100 mg蛋白加PBS 1 mL)，超聲破碎儀破碎組織后制成勻漿，12 000 r/min離心10 min后取上清，BCA方法測定蛋白濃度。用ELISA試劑盒測定大鼠海馬TNF-α和IL-1β含量,嚴格按照試劑盒說明書操作，酶標儀測定標準品和樣品的吸光度值。根據(jù)標準品的濃度和吸光度值繪制標準曲線，計算樣品中TNF-α、IL-1β的濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)和組織的總蛋白濃度計算海馬TNF-α、IL-1β的含量。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 NDS評分

與Sham組比較,IR組、SP組、SPD組及PD組NDS評分明顯升高，SP組NDS評分明顯低于IR組，SPD組NDS分明顯高于SP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠NDS評分(n=16)Tab.1 NDS score of rats in 5 groups

注：(1)與Sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05；(3)與SP組比較，P<0.05。

2.2 腦梗死體積

與Sham組比較，IR組、SP組、SPD組及PD組腦梗死體積明顯升高，SP組腦梗死體積明顯低于IR組，SPD組腦梗死體積明顯高于SP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為TTC染色，B為腦梗死體積比較的直條圖；(1)與Sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05；(3)與SP組比較，P<0.05。圖1 5組大鼠缺血再灌注24 h后腦梗死面積Fig.1 Cerebral infarction area after 24 hours of ischemia-reperfusion in 5 groups of rats

2.3 AT2R蛋白含量

與Sham組比較，IR組、SP組、SPD組及PD組AT2R蛋白含量明顯上調，SP組AT2R蛋白含量明顯高于IR組，SPD組AT2R蛋白含量明顯低于SP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與Sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05；(3)與SP組比較，P<0.05。圖2 5組大鼠腦缺血側海馬AT2R相對表達量Fig.2 Relative expression of AT2R in hippocampus of rats with cerebral ischemia in 5 groups

2.4 TNF-a、IL-1β含量

與Sham組比較,IR組、SP組、SPD組及PD組海馬TNF-a、IL-1β含量明顯上調；與IR組比較，SP組海馬TNF-a、IL-1β含量明顯降低；與SP組比較，SPD組海馬TNF-a、IL-1β含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠TNF-a、IL-1β含量Tab.2 TNF-a, IL-1 β content in 5 groups of rats

注：(1)與Sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較,P<0.05；(3)與SP組比較，P<0.05。

3 討論

AT2R是一個由363個氨基酸編碼組成的7次跨膜蛋白，研究表明腦內AT2R受體激活可以通過激活BDNF、PPAR-γ等多通路，促進腦部神經(jīng)細胞分化、神經(jīng)軸突生長、減輕氧化應激反應、神經(jīng)炎癥、增加腦血流量，抗細胞凋亡作用，是神經(jīng)系統(tǒng)內源性保護通路之一[11]。在未成熟的大腦，AT2R表達豐富且分布廣泛，主要集中在與運動、感覺、學習相關的中樞區(qū)域及邊緣系統(tǒng)的某些結構如海馬等，在成年大鼠中，這些部位的AT2R顯著減少維持較低水平，但在腦缺血性損傷后AT2R表達量上調[12]。文獻報道在大腦中動脈阻塞后，AT2R基因敲除大鼠缺血性腦損傷較野生型(Agtr2 +)更嚴重[13]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷24 h后AT2R才緩慢升高，7 d后達到高峰；給予AT2R激動劑激活AT2R后，大鼠腦梗死面積減小，神經(jīng)行為障礙明顯得到改善[7]。在本試驗中，缺血再灌注24 h后，與Sham組比較,各組AT2R表達量增加，這與上述成年大鼠AT2R顯著減少維持較低水平，腦缺血性損傷后AT2R表達量緩慢上調的研究結論一致；而經(jīng)過七氟醚預處理后的SP組AT2R蛋白表達量明顯增加，使用了AT2R拮抗劑的SPD組AT2R蛋白表達量明顯下降，說明在缺血-再灌注損傷中，七氟醚預處理提前激活了腦血管緊張素AT2R的表達。推測PD組可能是由于成年大鼠AT2R蛋白維持較低水平以及在缺血-再灌注損傷前腹腔注射1mg/kg的AT2R拮抗劑PD123319劑量偏少的緣故，AT2R蛋白表達量與IR組、SPD相比無明顯差異。

本研究采用線栓栓塞大腦中動脈制作大鼠腦局灶性腦缺血-再灌注模型，采用缺血2 h，再灌注24 h來模擬臨床上常見的大腦缺血再灌注損傷，通過神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死體積百分比兩方面來來判斷各組腦缺血再灌注損傷的結果。試驗結果顯示，與Sham組比較，IR組神經(jīng)功能評分與腦梗死體積明顯升高，說明缺血再灌注損傷模型建立成功。文獻報道每天吸入2.5%七氟醚1 h、連續(xù)5 d，可明顯減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，產(chǎn)生腦保護作用[14]。本試驗也采用該方案，研究顯示SP組的腦梗死百分比、神經(jīng)功能缺陷評分比IR組明顯降低。說明本試驗中采用的七氟醚預處理方案對缺血再灌注損傷起到保護作用。

一些研究證實免疫、炎癥反應與缺血性損傷有關，在缺血再灌注損傷后腦組織和血漿中TNF-α、IL-1β等細胞因子發(fā)生改變[15-17]。在本實驗中除Sham組外，各組大鼠腦缺血再灌注24 h后海馬TNF-α、IL-1β明顯升高，說明炎癥反應在腦缺血再灌注損傷中確實起著重要作用；與SP組相比，IR組、SPD及PD組TNF-α、IL-1β增加，腦損傷加重，這也說明了七氟醚預處理通過減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應，產(chǎn)生了保護作用[18]。文獻報道在大腦中動脈阻塞后，給入AT2R激動劑C21，促炎細胞因子TNF-α、IL-1β等表達明顯降低[19]。在本實驗中，與使用了AT2R阻斷劑的SPD組相比，七氟醚預處理后的SP組AT2R明顯增加，炎癥因子TNF-α、IL-1β卻降低，說明七氟醚預處理激活了AT2R蛋白，降低了腦的炎癥反應。

綜上所述，七氟醚預處理減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的機制可能與提前上調腦血管緊張素AT2R，進而抑制缺血后的急性炎性反應有關。在本實驗中并沒有對七氟醚是通過什么通路激活腦血管緊張素AT2R進行研究，AT2R確切的激活機制尚有待于進一步研究[20-21]。七氟醚具有血氣分配系數(shù)(0.63)低，刺激性小，吸收、清除快和麻醉維持可控等優(yōu)點，且在臟器保護方面有潛在價值，通過對其保護機制的進一步研究,可以更好地指導圍術期臟器缺血保護及臨床治療。