程熠，郭秋云，于世英，黃南，秦凱，趙荊，熊慧華

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1.腫瘤科；2.過敏反應(yīng)科，武漢 430030)

近年來，宮頸癌發(fā)病率逐年遞增，且呈年輕化趨勢(shì)，所以尋找一種高效的治療藥物刻不容緩。研究發(fā)現(xiàn)，大部分中藥提取物具有耐藥性低、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，如珊瑚姜油[1]、莪術(shù)油[2]、藍(lán)萼香茶菜[3]等，均已在細(xì)胞學(xué)水平上證實(shí)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抗癌活性[4]。最新研究證實(shí)，苦參堿(matrine,Mat)在體內(nèi)外對(duì)腫瘤具有較好的抑制作用[5-6]。筆者在本研究重點(diǎn)分析Mat對(duì)人體外培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1主要試劑 Mat(西安天園生物制劑公司，批號(hào)：16092517，含量：≥99%)；小牛血清(德國PAA公司)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle's medium,DMEM)(Hyclone 公司，批號(hào)：AD22391271)；二甲亞砜(DMSO，Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：RNBF8134)；考馬斯亮藍(lán)染液(海門市碧云天生物技術(shù)研究所)；噻唑藍(lán)(MTT，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：M8180)；碘化丙啶(propidium iodide，PI，Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：P4170)。

1.2儀器 培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，型號(hào)：HWJ-3-270)；酶標(biāo)儀(美國伯滕儀器有限公司，型號(hào)：Lx800)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：ZXPO)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞系為本醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)環(huán)境為濃度為10%小牛血清，DMEM；在5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)。

1.4MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌HeLa細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為每孔6×103個(gè)，在96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔細(xì)胞懸液體積為200 μL，培養(yǎng)4～6 h后待細(xì)胞完全貼壁，貼壁后加入0.5，1.0，1.5和2.0 g·L-1Mat，設(shè)置對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于72 h后停止培養(yǎng)。細(xì)胞形態(tài)及密度在倒置顯微鏡下觀察，在每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，保持37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，最后避光搖勻，10 min后采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A值)，波長(zhǎng)為490 nm。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)宮頸癌HeLa細(xì)胞周期分布 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，使用不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，同步細(xì)胞周期，當(dāng)細(xì)胞貼合度達(dá)到60%后，設(shè)置對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入2.0 g·L-1Mat，培養(yǎng)72 h，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次，每孔2×106個(gè)，在4 ℃條件下，使用75%乙醇-20 ℃固定1 h，棄乙醇，使用PBS 400 μL重懸細(xì)胞后，依次加入核糖核酸酶A(ribonuclease A, RNaseA)20 μL，37 ℃水浴30 min，400目篩網(wǎng)濾過，加入PI 400 μL染色30 min，輕輕混勻后4 ℃避光孵育1 h，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期比率，使用ModFit LT軟件獲取數(shù)據(jù)。

1.6Western boltting檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Wee1、CyclinA、CDC2和CyclinB的變化

1.6.1蛋白樣品制備 ①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液。②將細(xì)胞密度調(diào)整為每孔2×105個(gè)，在6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔細(xì)胞懸浮液體積為2 mL，細(xì)胞貼壁后，棄液，分別在培養(yǎng)基2 mL加入濃度為0.5,1.0,1.5和2.0 g·L-1Mat，對(duì)照組加入無菌PBS溶液2 mL。③在冰上進(jìn)行下述操作，利用4 ℃預(yù)冷PBS溶液沖洗細(xì)胞3次，棄PBS溶液。④每一個(gè)孔加入蛋白裂解液，置于冰上裂解10 min。⑤使用細(xì)胞刮將孔中細(xì)胞刮下置于預(yù)冷的EP試管中，在4 ℃條件下離心30 min,離心結(jié)束后將細(xì)胞置于冰上，備用。

1.6.2測(cè)量蛋白含量 使用考馬斯亮藍(lán)染液2 mL,按照1：1000的比例與蛋白樣品混合均勻，利用分光光度儀測(cè)定蛋白質(zhì)。

1.6.3蛋白變性 將2%β-巰基乙醇加入放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液及蛋白液中，蛋白濃度保持1 mg·mL-1，煮沸10 min后置于冰上冷卻，儲(chǔ)于-70 ℃冰箱中備用。

1.6.4電泳 根據(jù)蛋白濃度配置對(duì)應(yīng)的分離膠，在玻璃板夾層中均勻灌入，使用雙蒸水封閉上層。在玻璃夾層中灌入對(duì)應(yīng)比例的濃縮膠，插入梳子，30 min后將梳子拔出，煮沸蛋白樣品50 μg，離心后8 V電泳30 min，后120 V電泳90 min。

1.6.5轉(zhuǎn)膜 ①將蛋白區(qū)域內(nèi)凝置于半干緩沖液中浸泡20 min。②切割濾紙和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，濾紙和甲醇活化PVDF膜60 s,置于半干轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡。③根據(jù)蛋白質(zhì)分子量,在100 V恒壓轉(zhuǎn)膜1～2 h。

1.6.6封閉 使用5%脫脂牛奶室溫封閉膜60 min。

1.6.7抗體孵育 ①膜使用1×Tris緩沖液-Tween (Tris buffered solution-Tween，TBST)清洗3次，每次10 min。②根據(jù)蛋白將抗體1×TBST/1%BSA稀釋對(duì)應(yīng)濃度，恒溫4 ℃搖床孵育過夜。③膜使用1×TPBS清洗3次，每次10 min。④應(yīng)用TBST將二抗稀釋移動(dòng)濃度，室溫下?lián)u床孵育60 min。⑤膜使用1×TBST清洗3次，每次10 min。

1.6.8洗膜 在洗膜盒中加入PVDF膜，底面向下，添加適量TBST液體洗滌3次，每次10 min。

1.6.9顯影 將適量辣根過氧化氫酶顯影液滴在膜表面，攝像保存凝膠成像系統(tǒng)。

2 結(jié)果

2.1不同濃度Mat對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響 同一時(shí)間內(nèi)，HeLa細(xì)胞增殖抑制率隨著Mat濃度增加而升高(P<0.01)；HeLa細(xì)胞增殖抑制率隨著Mat作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高(P<0.01)，HeLa細(xì)胞增殖抑制率與Mat濃度、作用時(shí)間相互關(guān)系明顯(P<0.01)，HeLa細(xì)胞增殖抑制率在2.0 g·L-1Mat72 h中達(dá)到峰值，為(62.10±0.36)%，見表1。

表1 不同濃度Mat對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2Mat對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，2.0 g·L-1Mat誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡比率上升明顯(P<0.05)。見表2。

表2 Mat誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞前后各細(xì)胞周期比率的變化

2.3Western boltting檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá) Western boltting檢測(cè)不同濃度Mat處理細(xì)胞72 h后，發(fā)現(xiàn)周期相關(guān)蛋白Wee1呈上升趨勢(shì)，CyclinA、CyclinB和CDC2呈下降趨勢(shì)，見表3；2.0 g·L-1Mat處理相關(guān)蛋白Wee1上升明顯，CyclinA、CyclinB和CDC2呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)，見圖1。

表3 不同濃度Mat對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)的影響

3 討論

宮頸癌的發(fā)病是一個(gè)緩慢遞進(jìn)，受多種因素影響，又相互制約的復(fù)雜過程。涉及病灶細(xì)胞不規(guī)則生長(zhǎng)，細(xì)胞外基質(zhì)被降解、間質(zhì)中進(jìn)入原發(fā)瘤細(xì)胞、間質(zhì)中瘤細(xì)胞移動(dòng)并與脈管接觸、瘤細(xì)胞脫離血管內(nèi)皮進(jìn)入血液，形成病灶轉(zhuǎn)移[7]?，F(xiàn)階段藥物化療是治療宮頸癌的重要方式之一，但會(huì)對(duì)正常組織產(chǎn)生損傷，局限其臨床應(yīng)用。傳統(tǒng)中藥具有副作用小、抗腫瘤效果明確的優(yōu)勢(shì)，成為臨床研究的重點(diǎn)話題。開發(fā)中藥分子水平的中藥學(xué)作用機(jī)制，逐步開發(fā)新型抗癌藥物作為治療腫瘤手段的潛力。

圖1 Mat處理HeLa細(xì)胞后周期相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)

Mat是苦參干燥根中提取的生物堿活性成分，臨床藥理學(xué)應(yīng)用較廣泛。近年研究發(fā)現(xiàn)，Mat對(duì)結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[6,8]。也有研究顯示，Mat可有效抑制裸鼠體內(nèi)成瘤能力和體外宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖能力[9]。Mat可通過多種作用機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖：①它可通過限制腫瘤細(xì)胞正常代謝，抑制端粒酶的活性及表達(dá)，使DNA模式甲基化，改變細(xì)胞信號(hào)抑制腫瘤細(xì)胞增殖；②通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞的黏附力，繼而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；③通過抑制腫瘤細(xì)胞的炎癥發(fā)展，降低化療藥物的毒副作用，降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7-9]。

中藥抗癌的主要作用機(jī)制可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mat能夠有效抑制體外培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，與SJAO等[11]研究結(jié)果相似。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)間內(nèi)，HeLa細(xì)胞增殖抑制率隨著Mat濃度增加而升高，HeLa細(xì)胞增殖抑制率隨著Mat作用時(shí)間增加而升高。符合GUO等[12-13]臨床研究結(jié)果，后者研究指出Mat可通過誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞增殖，說明Mat在治療宮頸癌方面具有較高的臨床價(jià)值。HeLa細(xì)胞增殖抑制率與Mat濃度、作用時(shí)間相互關(guān)系明顯，宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖抑制率在2.0 g·L-1Mat72 h中達(dá)到峰值，濃度2.0 g·L-1和作用時(shí)間72 h為本次實(shí)驗(yàn)最高濃度和最長(zhǎng)時(shí)間，增加濃度或延長(zhǎng)時(shí)間能否抑制作用更強(qiáng)，仍有待研究。

細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化均受細(xì)胞內(nèi)外多種信號(hào)調(diào)控，多種信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)發(fā)生基因突變時(shí)，細(xì)胞就會(huì)失衡，出現(xiàn)無限增殖，形成腫瘤。Cyclin細(xì)胞家族是在細(xì)胞轉(zhuǎn)換和進(jìn)行的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[14]。其表達(dá)水平與細(xì)胞周期密切相關(guān)，可結(jié)合特定的蛋白激酶發(fā)揮活性，從而調(diào)控細(xì)胞各個(gè)周期代謝增殖。CyclinA濃度在細(xì)胞進(jìn)入S周期時(shí)到達(dá)高峰，而HeLa細(xì)胞的特點(diǎn)是惡性增生，細(xì)胞周期運(yùn)行過程中，CyclinA直接調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化越差，CyclinA表達(dá)水平越低。由此推測(cè)HeLa細(xì)胞增殖水平逐漸下降，CyclinA水平降低。CyclinA位于細(xì)胞核，在DNA形成前出現(xiàn)，較CyclinB之前表達(dá)，在G1和S1期之間形成屏障隔離，CyclinB大量存在于細(xì)胞質(zhì)中，在S晚期到達(dá)峰值。研究顯示，CyclinB在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)呈現(xiàn)出腫瘤特性。由此推測(cè)Mat通過誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致CyclinB濃度降低。Wee1蛋白激酶是蘇氨酸蛋白家族的一員，可通過抑制CDC2的活性限制細(xì)胞有絲分裂，減少真核生物體積[15]。在機(jī)體中，Wee1蛋白含有647個(gè)氨基酸，在胚細(xì)胞和體細(xì)胞中均表達(dá)豐富。Wee1蛋白激酶的調(diào)節(jié)主要包括Wee1蛋白激酶的特定位點(diǎn)的磷酸化和Wee1蛋白激酶的降解兩部分。Wee1蛋白激酶的降解是泛素依賴的蛋白質(zhì)降解，M期是蛋白質(zhì)降解主要時(shí)期，因?yàn)镃DK1的激活，對(duì)恢復(fù)被DNA損傷檢查激活引起的停止的細(xì)胞周期是必不可少的。在腫瘤細(xì)胞中Wee1蛋白激酶與被磷酸化的Ser53和pS121位點(diǎn)相結(jié)合發(fā)生降解，研究顯示，Wee1蛋白與DNA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[16]。由此推測(cè)在形成HeLa細(xì)胞降解時(shí)期Wee1持續(xù)增高。本次實(shí)驗(yàn)研究顯示，Western boltting檢測(cè)不同濃度Mat處理細(xì)胞72 h后發(fā)現(xiàn)周期相關(guān)蛋白Wee1呈上升趨勢(shì)，CyclinA、CyclinB和CDC2呈下降趨勢(shì)，在1.5和2.0 g·L-1Mat處理組4個(gè)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Mat可有效改變體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞，通過提升蛋白Wee1水平促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低CyclinA、CyclinB和CDC2水平抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，Mat對(duì)體外培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制作用明顯，可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程來實(shí)現(xiàn),為臨床應(yīng)用中藥治療宮頸癌提供了新思路。