黃秒 董國(guó)慶 肖菲 張紀(jì)泳 蘇月月 李明珠

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院兒科（廣東深圳518028）

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種由炎癥風(fēng)暴導(dǎo)致涉及全身非特異性中小血管炎，病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，推測(cè)可能受感染、遺傳、環(huán)境、免疫及炎癥等多種因素有關(guān)，未經(jīng)治療患兒其中有20%～25%合并冠狀動(dòng)脈損害（coronary artery lesion，CAL）［1］。研究［2］證實(shí)，抵抗素（resistin，RETN）參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)冠心病的發(fā)生、發(fā)展。有文獻(xiàn)［3］報(bào)道抵抗素基因啟動(dòng)子-420位點(diǎn)C/G多態(tài)性影響血清抵抗素水平。至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)抵抗素基因中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其中研究得最多的是RETN啟動(dòng)子-420C＞G（rs l862513）位點(diǎn)，且RETN-420C＞G多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈疾病、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)［4］。目前有關(guān)川崎病與抵抗素基因多態(tài)性文章研究較少，且結(jié)論不一。有研究表明抵抗素基因-420C/G（rs1862513）位點(diǎn)多態(tài)性與川崎病有關(guān)［5］。為探討抵抗素基因-420C/G位點(diǎn)多態(tài)性與川崎病的關(guān)系，本文選取81例川崎病患兒和100例健康兒童作為研究對(duì)象，分析抵抗素基因-420C/G位點(diǎn)多態(tài)性及其血清抵抗素水平，為預(yù)防和控制川崎病及其冠脈損傷提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選2014年1月至2016年12月深圳市婦幼保健院住院KD患兒81例作為KD組；KD診斷和冠狀動(dòng)脈損傷診斷參考《實(shí)用兒科學(xué)（第7版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。KD組年齡3個(gè)月至6歲，平均（1.8±1.5）歲，男49例，女32例。根據(jù)是否合并冠狀動(dòng)脈損傷，分為CAL組，11例均為輕度冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張，年齡8個(gè)月至6歲，平均（2.3±1.7）歲，男8例，女3例；冠狀動(dòng)脈正常組（NCAL組）70例，年齡3個(gè)月至6歲，平均（1.7±1.4）歲，男47例，女23例。另選同時(shí)間段在我院體檢的健康兒童100例作為正常對(duì)照組，均排除既往疾史，經(jīng)常規(guī)體格檢查、肝功能、腎功能、尿常規(guī)等檢查均無(wú)異常。對(duì)照組年齡4個(gè)月至6歲，平均（2.0±1.3）歲，男65例，女35例。KD組與正常對(duì)照組在年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)CAL組與NCAL組年齡和性別比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。KD組與正常對(duì)照組人群抵抗素-420均符合Hardy-Weinberg遺傳定律（P＞0.05），表示本研究選取研究對(duì)象具有群體代表性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的采集與保存研究已獲得深圳市婦幼保健院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，取得所有研究對(duì)象及監(jiān)護(hù)人知情同意，取外周靜脈血4 mL，取2 mL用全血基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司，編號(hào)SK8224）提取總DNA；然后紫外分光光度儀測(cè)定DNA純度和含量，A260/A280在1.7～2.0之間，并計(jì)算產(chǎn)物濃度。將DNA保存-80℃超低溫冰箱備用。剩余2 mL置于含肝素鋰的真空采血器中，分離血清，-80℃冰箱保存，集中時(shí)間統(tǒng)一采用ELISA法測(cè)定血清抵抗素。

1.2.2血清抵抗素水平測(cè)定所有研究對(duì)象用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清抵抗素水平，試劑盒由美國(guó)R&D公司提供。

1.2.3抵抗素基因-420C/G位點(diǎn)基因多態(tài)檢測(cè)（1）引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增。采用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，并委托上海生工合成。人抵抗素基因-420位點(diǎn)體外擴(kuò)增的引物如下：正向引物：5′-TGGCTTGGCTAATAAGTCCCT-3′，反向引物：5′-GTTGCCCAGACTGGAGTGC-3′，片段大小 395 bp。PCR反應(yīng)體系（25 μL）如下：樣本DNA 為1 μL，正反向引物各為0.5 μL，dNTP 10 mmol/L 取0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，Taq酶5 U/μL 0.2 μL，水為20 μL。PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30～60 s，總共35個(gè)循環(huán)；72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，確定為目的產(chǎn)物。（2）基因分型。取PCR產(chǎn)物20 μL由上海生工測(cè)序。測(cè)序的步驟如下：①制備樣本（過(guò)膜或切膠）；②用雙脫氧鏈終止法PCR擴(kuò)增；③3730xl DNA Analyzer測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，并輸出結(jié)果。（3）PCR產(chǎn)物測(cè)序的結(jié)果。用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工，編號(hào)B518131），通過(guò) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢r(jià)s1862513（人抵抗素基因SNP-420C/G）基因序列CAGGGCCTCCVTCTTCATGTC，測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)3種基因型CC、CG和GG，見(jiàn)圖1。

圖1 rs1862513（人抵抗素基因SNP-420C/G）基因序列CAGGGCCTCCVTCTTCATGTCFig.1 rs1862513（Human RETN gene SNP-420C/G）gene sequence CAGGGCCTCCVTCTTCATGTC

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，3組間的比較用單因素方差分析；基因型及等位基因頻率采用R×C表χ2檢驗(yàn)；對(duì)照組、病例組進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1KD患兒基因多態(tài)性分布情況81例KD患兒中抵抗素基因-420基因型CC型、CG型、GG型頻率分別為18.5%（15/81）、44.4%（36/81）、37.1%（30/81）；100例正常兒童抵抗素基因-420基因頻率分別為13%（13/100）、51%（51/100）、36%（36/100）。抵抗素基因-420位點(diǎn)CC、GC、GG基因型頻率及C和G等位基因頻率在KD組和正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 KD組與正常對(duì)照組抵抗素-420位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的比較Tab.1 Genotypes and allele frequencies of the resistin gene in Kawasaki disease（KD）patients and the controls 例（%）

2.2KD合并CAL組與NCAL組抵抗素-420位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的比較70例無(wú)CAL者中抵抗素基因-420基因型CC型、CG型、GG型頻率分別為18.6%（13/70）、42.8%（30/70）、38.6%（27/70）；11例并CAL者抵抗素基因-420基因頻率分別為18.2%（2/11）、54.5%（6/11）、27.3%（3/11）。KD組中并CAL者與NCAL者基因型分布頻率和等位基因頻率比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.621、0.234，P=0.838、0.628）。見(jiàn)表2。

2.3各組血清抵抗素水平比較KD組血清抵抗素水平（30.06±5.86）ng/mL較正常對(duì)照組（25.64±9.00）ng/mL明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.725，P＜ 0.001），見(jiàn)圖2A。合并CAL血清抵抗素水平與未合并CAL組比較［（31.27±3.82）ng/mLvs.（29.87±6.13）ng/mL］差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.730，P=0.467），見(jiàn)圖2B。KD組抵抗素基因-420基因型CC、GG、CG血清抵抗素比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.785，P=0.175），見(jiàn)圖2C。正常對(duì)照組抵抗素基因-420基因型CC、GG、CG血清抵抗素比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.544，P=0.582），見(jiàn)圖2D。

表2 CAL組與NCAL組抵抗素-420位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的比較Tab.2 Genotypes and allele frequencies of the resistin gene in KD patients with CAL and without CAL 例（%）

圖2 組間血清抵抗素比較Fig.2 Comparison of serum resistin levels between different groups

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)一些基因單核苷酸的多態(tài)性與川崎病發(fā)生及其并發(fā)冠狀動(dòng)脈病變有關(guān)［7］。抵抗素基因是編碼人類(lèi)抵抗素蛋白，位于19p13.3，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。研究［8］發(fā)現(xiàn)，抵抗素基因多態(tài)性420C/G可能與心血管事件發(fā)病密切相關(guān)。MITANI等［9］研究表明，幼年時(shí)患有川崎病患兒合并輕度冠脈損傷成年后患缺血性心臟病。因此，早期篩選冠心病高危人群，提早預(yù)防，具有重大意義。本研究川崎病患兒抵抗素-420基因多態(tài)性與正常兒童比較，發(fā)現(xiàn)抵抗素-420基因多態(tài)性在兩組人群中并無(wú)差異，提示抵抗素基因-420C/G位點(diǎn)與川崎病發(fā)生無(wú)關(guān)。同時(shí)分析合并冠脈損傷川崎病患兒與未合并冠脈損傷比較，抵抗素-420基因多態(tài)性亦無(wú)差異，提示抵抗素基因-420C/G位點(diǎn)與川崎病冠脈損傷發(fā)生不相關(guān)。目前對(duì)于抵抗素基因多態(tài)性在川崎病的研究不多，但結(jié)論不一。LIU等認(rèn)為川崎病患兒抵抗素基因-420多態(tài)性與冠脈損傷不相關(guān)，與本研究一致。但也有研究［3］認(rèn)為，抵抗素基因-420多態(tài)性在川崎病患兒中分布有差異。因本研究中川崎病合并冠脈損傷均為輕度冠脈擴(kuò)張，且樣本量偏少，具有一定的局限性，因此，抵抗素多態(tài)性與川崎病冠脈損傷有無(wú)關(guān)系需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)。

研究證實(shí)，抵抗素基因-420多態(tài)性在日本人群與抵抗素血清學(xué)水平相關(guān)。在本研究中，正常健康兒童中抵抗素3種基因型血清抵抗素比較亦無(wú)差異，考慮可能與人群種族有關(guān)，需進(jìn)一步大樣本研究。同時(shí)，本研究KD組中三種基因型CC、CG、GG血清抵抗素比較無(wú)差異，提示在川崎病患兒中抵抗素-420多態(tài)性與血清抵抗素水平無(wú)相關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)川崎病患兒中血清抵抗素較正常健康兒童明顯增高，具有顯著性差異，提示抵抗素水平變化可能與川崎病有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素作為一種促炎因子，炎癥時(shí)在人體內(nèi)表現(xiàn)為高抵抗素狀態(tài)。研究證實(shí)，抵抗素可通過(guò)激活炎癥因子NF-κB途徑增加血管細(xì)胞黏附分子等表達(dá)，從而使單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，致內(nèi)皮功能的紊亂，引起高抵抗素血癥，導(dǎo)致血管的炎癥［10］。本研究中發(fā)現(xiàn)川崎病患兒抵抗素水平明顯增高可能與炎癥有關(guān)。ZHANG等［11］證明脂肪因子與急性川崎病早期炎癥密切相關(guān)，與本研究一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)合并冠脈損傷川崎病患兒與未合并冠脈損傷抵抗素比較無(wú)差異，提示川崎病抵抗素水平與冠脈損傷不相關(guān)。

綜上所述，KD患兒血清抵抗素與KD發(fā)生有關(guān)，尚未發(fā)現(xiàn)抵抗素基因-420C/G位點(diǎn)與川崎病及其CAL的發(fā)生存在明顯關(guān)聯(lián)性。因樣本量偏小，本研究仍存在一定局限性，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本并作深入探討。