付寧 仵紅嬌 謝俞寧 李昂 賈禎賢 張雪梅

華北理工大學生命科學學院（河北唐山 063210）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上第3常見的癌癥，發(fā)病率位于第3位且病死率僅次于肺癌［1］。盡管美國、澳大利亞、加拿大、新西蘭和歐洲部分地區(qū)的CRC發(fā)病率較高，亞洲、非洲和南美人口面臨的風險最低［2］，我國結直腸癌發(fā)病率占第3位并且病死率占第4位［3］。此外，生活方式和飲食習慣可能導致結直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因［4］和也是研究熱點［5-6］。CD55是膜結合型補體調節(jié)蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins，mCRPs），參與結直腸癌［7］、乳腺癌［8］、宮頸癌［9］和肝癌［10］等腫瘤細胞的逃逸過程。此外，CD55 rs2564978多態(tài)性與結直腸癌的發(fā)病風險關系尚未明確。本研究應用GEPIA分析CD55在結直腸癌中的表達情況；使用病例-對照研究方法，探討CD55 rs2564978多態(tài)性對結直腸癌發(fā)病風險的影響。本研究旨在為結直腸癌病因研究和臨床治療提供潛在靶標。

1 資料與方法

1.1一般資料本研究于華北理工大學附屬唐山市工人醫(yī)院、華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院收集自2008年4月起至2012年12月結直腸癌患者的外周血樣本。其中結腸癌患者410例，直腸癌患者480例，所有癌癥病例均經(jīng)過病理學檢驗確診。收集醫(yī)院體檢中心同一時期進行體檢的健康人群外周血，對照組按年齡和性別分別與病例組進行成組設計，隨機選取410例健康人外周血作為結腸癌對照組，隨機選取480例健康人外周血作為直腸癌對照組。對照組均無既往腫瘤史且與病例組無血緣關系。以查閱病歷資料和問卷調查方法收集研究對象一般人口學資料及臨床病理資料，全部研究對象均簽署知情同意書。本研究獲得華北理工大學倫理委員會批準。

1.2研究方法外周血提取DNA，使用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA提取試劑盒（DP318），嚴格按照試劑盒說明書進行操作，提取產(chǎn)物置于-20℃冰箱儲存。基因分型，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性技術。首先使用PCR技術擴增所需目的DNA片段，CD55 rs2564978上游引物序列：5′-ATGAACAATGTT CACTCCCTACTGTGGTA-3′和下游引物序列：5′-TAAGGAGGAAGGGCGTCATC-3′，由北京諾賽基因組研究中心有限公司進行引物合成。PCR反應體系：1×Taq PCR starmix 6 μL、DNA 2 μL、上下游引物各0.1 μL、去離子水1.8 μL，總體積9 μL。PCR擴增反應：94 ℃預變性3 min；94℃變性40 s、61.5℃退火 30 s、72℃延伸25 s，30個循環(huán)；72℃延伸3 min。擴增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶消化切割進行基因分型，酶切條件：加入限制性內(nèi)切酶RsaI（New England Biolabs，Hitchin，UK）37℃孵育過夜，可得TT基因型為一個101 bp的片段，CC基因型為79 bp和22 bp的兩個片段，CT基因型為101、79和22 bp三個片段，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。為保證本研究基因分型可靠性，隨機挑選10%樣本進行重復實驗，重復結果與原結果一致。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。使用χ2檢驗比較分類變量（如：性別、年齡和吸煙狀況）的分布及病例和對照組之間基因型的分布差異，使用非條件Logistic回歸計算比值比（odds ratios，OR）及95%置信區(qū)間（confidence intervals，CI）。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4生物信息學分析對國際共享數(shù)據(jù)庫Ensembl中CD55啟動子區(qū)SNP信息進行數(shù)據(jù)挖掘，篩選出可能影響基因表達或基因功能的SNP位點。且所篩選SNP位點的次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）在中國人群中＞ 0.05，利用TRANSFAC軟件對SNP位點進行預測，最終篩選出對轉錄因子結合有影響的SNP位點。

使用基因表達譜動態(tài)分析［11］（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/）在線數(shù)據(jù)庫進行表達差異分析，基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)，分析CD55在結直腸癌中癌組織和癌旁組織表達差異。

2 結果

2.1CD55rs2564978篩選及其在結直腸癌組織中的表達利用生物信息學篩選出對CD55轉錄因子結合有影響的SNP為CD55 rs2564978。此外，本研究納入TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫結腸癌組織349例、癌旁對照275例；直腸癌組織318例、癌旁對照92例。通過GEPIA分析其表達差異，結果發(fā)現(xiàn)在結腸癌和直腸癌組織中CD55基因的表達均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 CD55在結直腸癌癌組織和癌旁組織中的表達Fig.1 Expression of CD55 in colorectal cancer tissues and adjacent tissues

2.2研究對象人口特征情況本研究直腸癌病例男301例（62.7%），女179例（37.3%），其對照組男302例（62.9%），女178例（37.1%），平均年齡60歲。結腸癌男225例（54.9%），女185例（45.1%），其對照組男228例（55.6%），女182例（44.4%），平均年齡60歲。結果發(fā)現(xiàn)，病例組與對照組性別、年齡、吸煙和飲酒差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1），表示病例組與對照組間具有可比性。

表1 研究對象基本特征Tab.1 Basic characteristics of the research objects 例（%）

2.3CD55 rs2564978多態(tài)性與結腸癌和直腸癌發(fā)病風險關系結腸癌和直腸癌對照組中，基因型的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（HWE），說明該研究人群具有代表性。研究結果分析（表2）發(fā)現(xiàn)，直腸癌病例組CD55 rs2564978 TT基因型攜帶者135例（28.1%），CT基因型攜帶者247例（51.5%），CC基因型攜帶者98例（20.4%）；對照組CD55 rs2564978 TT基因型攜帶者163例（34.0%），CT基因型攜帶者237例（49.3%），CC基因型攜帶者80例（16.7%）。經(jīng)非條件Logistic回歸分析，與CD55 rs2564978 TT基因型攜帶者相比，CC基因型攜帶者直腸癌發(fā)病風險明顯升高（OR=1.479，95%CI：1.015 ～ 2.154，P=0.042）。結腸癌病例組CD55 rs2564978 TT基因型攜帶者113例（27.5%），CT基因型攜帶者216例（52.6%），CC基因型攜帶者81例（19.7%）；對照組CD55 rs2564978 TT基因型攜帶者146例（35.6%），CT基因型攜帶者192例（46.8%），CC基因型攜帶者72例（17.6%）。經(jīng)非條件Logistic回歸分析，CD55 rs2564978多態(tài)性與結腸癌發(fā)病風險無關（P＞0.05）。

2.4CD55 rs2564978多態(tài)性與直腸癌發(fā)病風險關系分層分析進一步對性別、年齡、吸煙和飲酒進行分層分析（表3）。與CD55 rs2564978 TT基因型相比，CC基因型可增加高年齡組（＞60歲）直腸癌患病風險（OR=2.116，95%CI：1.210 ～ 3.701，P=0.009），不影響低年齡組（≤60歲）直腸癌患者的發(fā)病風險（OR=1.088，95%CI：0.638 ～ 1.856，P=0.756）。性別、飲酒和吸煙分層分析結果發(fā)現(xiàn)CD55 rs2564978多態(tài)性與直腸癌發(fā)病風險無關（P＞0.05）。

表2 CD55多態(tài)性與結直腸癌發(fā)病風險關系Tab.2 Relationship between genetic variation of CD55 and risk of colorectal cancer 例

3 討論

衰變加速因子CD55是一種糖蛋白，通過糖基磷脂酰肌醇固定在細胞膜上，具有4個短的一致重復結構域［12］。CD55參與了補體過度活化，從而在某些形式的蛋白質丟失性腸病中的發(fā)揮作用［13-14］。通過干擾經(jīng)典和替代途徑中的C3/C5轉化酶抑制補體活化從而發(fā)揮補體抑制劑的作用［15］。CD55在惡性腫瘤組織中廣泛表達，能夠通過酪氨酸激酶途徑及特異性與CD59結合促進腫瘤的發(fā)生。在以往研究中，CD55可減少補體介導的腫瘤細胞裂解，促進新血管形成、侵襲和轉移［16］；CD55在血液系統(tǒng)腫瘤中高表達與慢性淋巴細胞白血病的治療有關［17］；此外在食管癌研究中，攜帶CD55 rs2564978 CC基因型可增加食管癌的發(fā)病風險，與吸煙交互作用共同影響食管癌發(fā)病風險［18］；并且CD55 rs2564978多態(tài)性增加了中國人群非小細胞肺癌的發(fā)病風險［19］；而CD55 rs2564978多態(tài)性與胃癌易感性有顯著的相關性［20］。

表3 CD55 rs2564978多態(tài)性與直腸癌發(fā)病風險關系分層分析Tab.3 Stratified analysis of the relationship between genetic variation of CD55 rs2564978 and the risk of rectal cancer 例

利用生物信息學篩選出對CD55轉錄因子結合有影響的SNP位點為CD55 rs2564978并且rs2564978位于CD55基因啟動子區(qū)，其在腫瘤方向的相關研究甚少。通過GEPIA分析，本研究發(fā)現(xiàn)CD55在結直腸癌患者中高表達。既往研究報道［21-22］在其啟動子區(qū)域內(nèi)，單核苷酸多態(tài)性可能影響轉錄活性。筆者推測在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中，CD55啟動子區(qū)rs2564978多態(tài)性可能影響CD55轉錄因子活性進而CD55表達發(fā)生了某種改變。通過PCR-RFLP發(fā)現(xiàn)，CD55 rs2564978多態(tài)性增加了中國北方人群的發(fā)病風險。與CD55 rs2564978TT基因型攜帶者相比，攜帶CC基因型可增加高年齡組直腸癌發(fā)病風險。然而，CD55 rs2564978多態(tài)性和結腸癌發(fā)病風險無關（P＞0.05）。本研究結果與筆者前期在食管癌［15］和肺癌［16］中研究結果一致。該研究說明CD55在結直腸癌中高表達并且結直腸癌遺傳易感性可能與CD55 rs2564978多態(tài)性有關，為結直腸癌的診斷提供了一個新的方向，探索結直腸癌診斷潛在分子標志物和治療靶點提供理論依據(jù)。

由于本研究選取研究對象均來自同一地區(qū)，并不能代表全國結直腸癌患者的情況，因此對這些結果加以解釋需要更加謹慎，還需其他地區(qū)人群作為研究對象增加實驗結果的可靠性。本研究僅對性別、年齡、飲酒及吸煙狀況進行了分析，結果具有一定局限性。