戎曉東 吳美萍 蔡維洵 陳炫光 戎煜明

華南國(guó)家腫瘤實(shí)驗(yàn)室/中山大學(xué)附屬腫瘤防治中心1放療科，3綜合科（廣州 510060）；2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州 510120）

PD-L1（CD274）作為介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸過程中的負(fù)性調(diào)控分子，在多種腫瘤中表達(dá)異常，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、原發(fā)性肝癌等，且其高表達(dá)與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)［1-5］。研究［6-7］證實(shí)，PD-L1不僅僅在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，而且在部分腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）上也有表達(dá)，包括頭頸鱗癌CSCs、結(jié)直腸CSCs等。PD-L1可通過激活PI3K/AKT通路從而促進(jìn)乳腺癌CSCs中OCT4、Nanog的表達(dá)［8］。然而在膽管細(xì)胞癌中，通過RNA干擾技術(shù)干擾PD-L1表達(dá)后小鼠更容易形成腫瘤，且“干性”增強(qiáng)，表現(xiàn)為ALDH+細(xì)胞比例增加，SOX2、OCT4、Nanog表達(dá)上調(diào)等。PD-L1在不同腫瘤CSCs中表現(xiàn)出相互矛盾的作用，這些證據(jù)表明，PD-L1在CSCs干性調(diào)節(jié)中發(fā)揮了不可或缺的作用，然而，其在肝癌CSCs中發(fā)揮的作用以及調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確。

CSCs是腫瘤發(fā)生的根源，是腫瘤放療抵抗的根本。放療在殺傷腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的過程中能釋放出大量的腫瘤抗原，且放療后腫瘤中浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞增多，因此，放療與抗PD-1/PDL1免疫治療在理論上是可行的。本研究擬初步探討PD-L1在肝癌CSCs中的表達(dá)及其對(duì)放療敏感性的影響，為腫瘤免疫治療聯(lián)合放療提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞株Huh-7細(xì)胞來自于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室；19例新鮮肝癌組織來自于南方醫(yī)院肝膽外科，患者均簽署知情同意書；BALB/c-nu/nu裸鼠20只，4周齡，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所；慢病毒PD-L1-shRNA-RFP訂購(gòu)于上海吉瑪公司；CD133、EpCAM流式抗體購(gòu)自R&D公司。

1.2方法

1.2.1PD-L1-shRNA轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)Huh-7肝癌細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將感染復(fù)數(shù)為100且攜帶RFP的PD-L1-shRNA慢病毒感染Huh-7細(xì)胞，24～48 h后顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。記為sh-PD-L1組。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞株及組織中干性基因及PD-L1的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)自TaKaRa公司。細(xì)胞及組織中RNA的提取按照試劑說明書進(jìn)行，對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，依照試劑盒說明書進(jìn)行。按照SYBR Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR說明書進(jìn)行。反應(yīng)液混合均勻后，放入機(jī)器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 s，95℃變性5 s、57℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，42個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行熔解曲線擴(kuò)增。通過相對(duì)定量來比較相關(guān)基因表達(dá)的差異。

1.2.3Western Blot檢測(cè)感染細(xì)胞中PD-L1蛋白的表達(dá)水平RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑按照100∶1混合后裂解Huh-7細(xì)胞，冰上裂解30 min，超聲破碎2 min，4℃下12 000 r/min離心30 min，吸取上清提取蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制聚丙烯酰胺凝膠，以總蛋白量50 μg/孔進(jìn)行電泳分離蛋白，恒流300 mA濕轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加一抗PD-L1（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000），室溫孵育2 h，加HRP 標(biāo)記的二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.4腫瘤成球?qū)嶒?yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用腫瘤球培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至（1～2）×106/mL，再取9 000個(gè)細(xì)胞鋪在100 mm低黏附皿中培養(yǎng)，于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)5～7 d后計(jì)數(shù)腫瘤球、拍照。

1.2.5CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)放療對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將不同分組肝癌細(xì)胞接種至96孔板中，待細(xì)胞貼壁后行細(xì)胞照射（2 Gy），之后按照試劑盒說明書不同天數(shù)檢測(cè)OD值計(jì)算抑瘤率。

1.2.6小鼠實(shí)驗(yàn)分別將轉(zhuǎn)染sh-PD-L1及空白對(duì)照的Huh-7細(xì)胞制成5×107/mL的單細(xì)胞懸液，分別接種至小鼠左側(cè)及右側(cè)皮下，每日觀察小鼠飲食、精神狀況及體重等的變化，待7 d成瘤后行皮下瘤放療，2 Gy/次，隔天1次，共行3次放療。每2天測(cè)量瘤體的最大長(zhǎng)徑（a）以及與之垂直方向的最大橫徑（b），腫瘤體積按照公式：V（mm3）=a×b2/2。14 d后采用脫頸法處死小鼠，摘取肝癌瘤體，稱重。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩個(gè)獨(dú)立組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PD-L1在肝癌CSCs中表達(dá)上調(diào)已有研究表明CD133及EpCAM可作為肝癌CSCs的標(biāo)記，利用流式分別分選出CD133、EpCAM陽性的肝癌細(xì)胞，利用qRT-CT檢測(cè)其PD-L1的表達(dá)，結(jié)果表明，PD-L1在CD133、EpCAM陽性為代表的肝癌CSCs中表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，圖1A）。進(jìn)而利用qRT-PCR檢測(cè)新鮮的肝癌組織中PD-L1及CD133、EpCAM基因的表達(dá)，結(jié)果表明PD-L1的表達(dá)與CD133、EpCAM表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.7936、0.8604）。見圖1B、C。以上結(jié)果表明，PD-L1在肝癌CSCs中表達(dá)上調(diào)，提示PD-L1在對(duì)肝癌干性調(diào)節(jié)可能發(fā)揮一定的作用。

圖1 PD-L1在肝癌CSCs中表達(dá)上調(diào)Fig.1 PD-L1 expression is up-regulated in hepatocellular carcinomacells

2.2利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建PD-L1表達(dá)下調(diào)的肝癌細(xì)胞株為了進(jìn)一步探討PD-L1在肝癌CSCs中發(fā)揮的作用，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)肝癌細(xì)胞Huh-7中PD-L1的表達(dá)，qRT-PCR（圖2A）及Western Blot（圖2B）證實(shí)PD-L1在sh-PD-L1組Huh-7肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

圖2 PD-L1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)Fig.2 PD-L1 expression is down-regulated in hepatocellular carcinoma cells

2.3干擾PD-L1表達(dá)后下調(diào)肝癌腫瘤細(xì)胞干性通過qRT-PCR檢測(cè)干性基因表達(dá)的情況發(fā)現(xiàn)，干擾PD-L1表達(dá)后，肝癌干性基因CD133、EpCAM、Nanog均有不同程度下調(diào)（圖3A）。結(jié)果表明，干擾PD-L1表達(dá)后，腫瘤成球能力下降（圖3B、C）。

圖3 干擾PD-L1表達(dá)后下調(diào)肝癌腫瘤細(xì)胞干性Fig.3 PD-L1 down-regulation led to inhibition of HCC stemness

2.4干擾PD-L1增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放療敏感性CCK8檢測(cè)提示PD-L1表達(dá)下調(diào)組與對(duì)照組增殖能力沒有差異（圖4A），利用上述細(xì)胞檢測(cè)PD-L1表達(dá)下調(diào)對(duì)放療敏感性的影響。PD-L1下調(diào)后肝癌細(xì)胞在體外對(duì)放療更敏感（圖4B）。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，PD-L1下調(diào)可顯著提高放療的療效，sh-PD-L1組小鼠腫瘤體積（圖4C）、瘤質(zhì)量均較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05，圖4D、E）。

3 討論

圖4 干擾PD-L1可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放療敏感性Fig.4 PD-L1 down-regulation led toincreased radiation sensitivity

CSCs是一類具有自我更新能力、無限增殖能力以及多向分化潛能的原始細(xì)胞［9］。目前認(rèn)為，CSCs的腫瘤發(fā)生的根源，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與放化療抵抗的根本［14］。因此，為獲得理想的抗癌效果，有效清除CSCs至為重要。既往研究表明，PD-L1在腫瘤CSCs中發(fā)揮了重要的調(diào)控功能［6-7］，然而，其在肝癌CSCs中的表達(dá)及功能目前尚未見明確的報(bào)道，本研究首次證實(shí)，在肝癌CSCs中PD-L1表達(dá)上調(diào)，而通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)PD-L1表達(dá)后肝癌的“干性”下降，提示PD-L1有可能作為一個(gè)針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療靶點(diǎn)。PD-1/PD-L1單抗為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種腫瘤治療中均有報(bào)道［15］。如何在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高PD-1/PD-L1單抗的療效是目前研究的重點(diǎn)。

近年研究發(fā)現(xiàn)，放療也可激活抗腫瘤免疫反應(yīng)［10-13］。研究表明放療可通過增強(qiáng)抗原遞呈作用促進(jìn)免疫應(yīng)答，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的活化、成熟［10-11］。此外，放療可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答提高腫瘤淋巴引流區(qū)T細(xì)胞的增殖活化，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)［12］。CHAKRABORTY等［13］研究表明放療后腫瘤組織中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞增多，提示放療可以改造腫瘤免疫微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)“冷腫瘤”到“熱腫瘤”的免疫微環(huán)境改造，基于此，放療聯(lián)合PD-1/PD-L1單抗免疫治療理論上是可行的，有希望能達(dá)到1+1＞2的療效。本研究中發(fā)現(xiàn)，干擾PD-L1的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞不管在體外細(xì)胞水平，或是在小鼠體內(nèi)水平，對(duì)放療射線的敏感性均有不同程度的提高，進(jìn)一步支持放療與PD-1/PD-L1單抗的聯(lián)用。

綜上所述，本研究初次探討了PD-L1在肝癌CSCs中的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)下調(diào)后肝癌放療敏感性提高，為后續(xù)PD-1/PD-L1單抗聯(lián)合放療理論提供依據(jù)。