徐巖 郄文斌 吳友平 屠偉峰

1第七十四集團軍醫(yī)院麻醉科（廣東惠州 516008）；2南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科（廣州 510000）

過度應激，如嚴重燒傷、創(chuàng)傷和重大手術等情況均可引起腸黏膜不同程度的損傷，嚴重影響患者的康復，然而目前尚無有效的防治手段。瞬時受體電位錨蛋白-1（transient receptor potential ankyrin-1，TRPA1）豐富表達于腸上皮細胞、腸嗜鉻細胞、肥大細胞和腸肌間神經叢以及支配腸的初級傳入神經元和其細胞體所在的相應階段的背根神經節(jié)。前期研究證明結腸內給予TRPA1的特異性激動劑2，4，6-三硝基苯磺酸或芥子油可引起嚴重的結腸炎，這和感覺神經元上TRPA1的激活密切相關［1］。因此本研究在應激前給大鼠腹腔注射TRPA1的特異性拮抗劑HC-030031，進一步闡明TRPA1在應激性腸黏膜損傷中的作用，為臨床有效預防腸黏膜損傷和促進腸道功能恢復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料雄性Wistar大鼠體質量（200±20）g，南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物實驗室提供。實驗前禁食12 h，自由飲水。

1.2研究方法

1.2.1實驗分組與制備動物模型大鼠24只隨機分為4組（n=6）：正常對照組（NC組）、WIRS回腸黏膜損傷模型組（WC組）、HCL組和HC2組。后3組放入鼠籠內，置（19±1）℃水中，水面平劍突。HC1組和HC2組于浸水束縛應激（water immersion restraint stress，WIRS）前1 h腹腔注射HC-030031（Sigma），劑量分別為100和200 mg/kg。WIRS 6 h后麻醉，取背根神經節(jié)（DRG）（T10-12）和回腸組織。

1.2.2 RT-PCR檢測DRG中TRPA1的mRNA表達Trizol提取總RNA后M-MLV反轉錄試劑合成cDNA。最后SYBR Premix Ex TaqⅡkit進行RTPCR。所用引物見表1。

表1 TRPA1和β-ACTIN實時熒光定量PCR引物Tab.1 RT-PCR primers for TRPA1 and β-actin

1.2.3Western Blot檢測回腸組織中TRPA1蛋白表達100 mg回腸組織加入500 μL RIPA裂解液，勻漿后冰上反應30 min，離心后取上清液。根據BCA法測定蛋白濃度。上樣，再經電泳、轉膜、封閉、一抗（TRPA1濃度1∶1 000）4℃孵育過夜、HRP二抗標記，ECL法曝光，Image J軟件進行目的條帶灰度值分析。

1.2.4免疫組織化學法檢測DRG和回腸組織中TRPA1的表達切片脫蠟至水-檸檬酸抗原修復-3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶-血清封閉、一抗（TRPA1濃度1∶400）4℃孵育過夜-二抗孵育1 h、DAB顯色、蘇木素復染。顯微鏡下觀察切片并拍照、Image-Pro Plus測OD值。

1.2.5回腸組織HE染色切片脫蠟至水，蘇木素-伊紅染色。顯微鏡下觀察各組切片并拍照、評分，評分標準參照［2］，評分越高，損傷越嚴重。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS 21.0軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，采用兩獨立樣本t檢驗或者one-way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1回腸黏膜病理損傷及評分NC組：腸黏膜形態(tài)正常。WC組：腸黏膜表層（約占黏膜全層的1/2）廣泛液化壞死、細胞剝脫，可見廣泛出血。部分區(qū)域黏膜層完全壞死，殘留黏膜固有層間質毛細血管充血明顯；部分區(qū)域黏膜表層剝脫，表層上皮細胞與固有層明顯分離。局部黏膜層中淋巴濾泡高度反應性增生，生發(fā)中心明顯。與NC組比較，WC組腸黏膜損傷嚴重，評分明顯增高（P＜0.001）；與WC組比較，HC1組和HC2組腸黏膜損傷情況明顯好轉，評分明顯降低（P＜0.01）；且HC2組比HC1組損傷評分更低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 HC-030031減輕WIRS誘導的回腸黏膜損傷病理學圖像Fig.1 Pathological images of HC-030031 alleviated WIRS-induced IML

2.2 DRG中TRPA1的mRNA表達與NC組相比，WC組DRG中TRPA1 mRNA表達明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖2。

2.3DRG中TRPA1蛋白表達與NC組相比，WC組DRG中TRPA1蛋白表達明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖3。

圖2 WIRS誘導DRG中TRPA1的mRNA表達上調Fig.2 WIRS up-regulation TRPA1 mRNA expression in DRG

圖3 WIRS誘導DRG中TRPA1蛋白表達上調Fig.3 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in DRG

2.4回腸中TRPA1的蛋白表達與NC組比較，WC組回腸中TRPA1蛋白表達明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖4。

2.5回腸組織中TRPA1蛋白表達與NC組相比，WC組回腸組織中TRPA1蛋白表達明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖5。

3 討論

圖4 WIRS誘導回腸組織中TRPA1蛋白表達上調（WB）Fig.4 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in ileal（WB）

圖5 WIRS誘導回腸組織中TRPA1蛋白表達上調（免疫組化）Fig.5 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in ileal（IHC）

TRPA1是與溫度、機械或化學刺激有關的非選擇性陽離子鈣通道，胞質內Ca2+是通道門控的重要調節(jié)因子。大量研究［3］表明TRPA1在急慢性疼痛、咳嗽和多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但是，TRPA1在應激性回腸黏膜損傷中的作用國內外尚未見報道，因此本文對此進行研究。筆者的免疫組織化學結果證實TRPA1在回腸和支配回腸相應階段的DRG（T10-12）有豐富表達。NOZAWA等［4］也報道，通過RT-PCR檢測，與其他器官相比，TRPA1在大鼠的小腸中mRNA表達水平最高，這些都決定了TRPA1在調控小腸的運動、分泌和血流中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)浸水束縛應激能誘導回腸和支配回腸組織相應階段DRG中TRPA1表達上調（圖2～5），回腸黏膜損傷。這可能是因為TRPA1被激活時可促使Ca2+通過TRPA1內流，引起下游通路P物質釋放，而P物質具有激活肥大細胞的生物學活性［5］。肥大細胞廣泛分布于內臟黏膜下的微血管周圍，被激活時可釋放組胺、5-HT、P物質、血小板活化因子、白三烯等物質；同時，TRPA1被激活時，可以改變上皮細胞的功能，促進腸嗜鉻細胞釋放大量5-HT，導致平滑肌細胞超極化，引起濃度依賴式的張力性血管舒張［6］，這些均可引起血管通透性增強及血管蛋白滲漏和中性粒細胞浸潤并參與炎癥反應［7-8］，導致回腸水腫、糜爛、潰瘍甚至出血。同時，P物質也能改變免疫功能，促進炎癥因子的釋放，引起腸黏膜損傷［9］。同時，筆者前期實驗研究發(fā)現(xiàn)TRPA1在支配胃腸道的背根神經節(jié)和感覺神經纖維中有功能表達［10-11］，所以，TRPA1能夠調節(jié)胃腸道炎癥和外源性傳入和傳出感覺神經纖維的作用［12］。TRPA1表達在腸上皮細胞、腸嗜鉻細胞、肥大細胞和一系列傷害性感覺神經元，其中很多細胞具有感覺特性，能與臨近的傷害性感受器（nociceptor）進行交流，介導炎癥反應，而炎癥反應在腸損傷中發(fā)揮重要作［13-14］。MEENTS等［13］報道TRPA1在傷害性感覺神經元中表達，可被內源性炎癥介質和氧化應激代謝物激活。這些因素共同作用引起腸黏膜損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)浸水束縛應激前給大鼠腹腔注射TRPA1特異性拮抗劑HC-030031，抑制TRPA1的表達，從而抑制了后續(xù)發(fā)生的一系列傷害性反應，可以明顯改善應激性腸黏膜的損傷情況。NAKAMURA等［15］研究證明，預先給于HC-030031可以明顯改善小鼠足底注射TRPA1的激動劑異硫氰酸烯丙酯引起的P物質釋放、傷害性行為、熱痛覺過敏、水腫和炎癥反應，這和筆者的研究結論相似。

總之，應激引起的急性腸黏膜損傷被認為是機體神經內分泌失調、局部腸黏膜缺血缺氧、腸黏膜嚴重的微循環(huán)障礙、細胞凋亡、炎癥細胞浸潤及各種促炎癥因子的產生等多因素共同作用，最終導致腸黏膜損傷因素增強、保護屏障破壞，維持腸黏膜完整性的平衡因子失調的后果。但是TRPA1具體通過哪些通路影響胃腸道功能，需要筆者進一步研究和探索。