李 彤 黃 娟 王 強(qiáng) 夏 楠 夏 強(qiáng) *

（1東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210096

2東南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 南京 210096

3蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇蘇州 215123）

脂質(zhì)納米粒（lipid nanoparticle，NP）是基于脂質(zhì)的極有效的藥物傳輸系統(tǒng)，主要分為固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carrier，NLC）兩種[1]。NLC由SLN改進(jìn)而成，它以一定比例的液態(tài)脂質(zhì)和固態(tài)脂質(zhì)為混合類脂，代替SLN中的固態(tài)脂質(zhì)作為載體材料[1]。與傳統(tǒng)的基于液態(tài)脂質(zhì)的給藥系統(tǒng)（乳液、脂質(zhì)體等）相比，NLC有更多優(yōu)點(diǎn)：高穩(wěn)定性、高包封率；保證親脂性成分被保護(hù)、控制和靶向釋放，提高了生物利用度，且低毒性，可低價(jià)工業(yè)化生產(chǎn)等[1]。

ω-3脂肪酸是食品補(bǔ)充劑、醫(yī)藥和營(yíng)養(yǎng)食品應(yīng)用中的必需脂肪酸之一[2]。早期，大量的研究報(bào)道ω-3脂肪酸有益于預(yù)防或治療認(rèn)知障礙、心血管疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、免疫功能障礙和炎癥[2]。亞麻籽油（Linseed oil）富含ω-3脂肪酸，已成為重要的功能食品成分[3]。然而，由于富含不飽和脂肪酸，所以亞麻籽油容易氧化酸敗[3]。通過(guò)NLC技術(shù)的封裝和添加抗氧化劑可有效預(yù)防油脂的氧化，從而保護(hù)亞麻籽油的功能特性[1，4]。Michotte 等[4]的研究表明：酚類化合物黃酮醇是亞麻籽油中不飽和脂肪酸的有效保護(hù)劑。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種天然多酚，它對(duì)人類健康有很大的益處，如抗氧化，抗炎，神經(jīng)保護(hù)，化學(xué)預(yù)防和化學(xué)治療效果等[5]。基于抗氧化性質(zhì)，Res具有清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA損傷以及改善內(nèi)源性抗氧化劑防御的能力[5]。盡管低溶解度和光不穩(wěn)定性限制了Res的應(yīng)用，利用納米技術(shù)還是可以克服這些問(wèn)題[5]。

考慮到亞麻籽油的功能特性和Res的抗氧化性，本文將這兩種功能成分共同封裝在NLC中，進(jìn)行一系列體外表征研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

白藜蘆醇（Res，98%，上海德恩得醫(yī)藥科技有限公司），亞麻籽油（加拿大TA Foods公司），中鏈甘油三酯（MCT，印度尼西亞Britz公司），單硬脂酸甘油酯（GMS，莘縣新星油脂有限公司），六聚甘油單硬脂酸酯（P6，上海日光化學(xué)貿(mào)易有限公司），水性單甘脂（廣州勝欣化工科技有限公司），甘油（Biosharp 公司），1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，東京化成工業(yè)株式會(huì)社），硫氰酸銨（上海麥克林生化科技有限公司），2-硫代巴比妥酸（TBA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 設(shè)備與儀器

FB-110Q高壓均質(zhì)機(jī)，上海勵(lì)途機(jī)械設(shè)備工程有限公司；RW20型數(shù)顯型懸臂攪拌器，德國(guó)IKA公司；EMS-20水浴磁力攪拌器，金壇市岸頭儀都儀器廠；JEM-2100透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；a-1900PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司；D8-Discover X射線衍射儀，德國(guó)Bruker公司；DSC-8000差式掃描量熱分析儀，美國(guó)PerkinElmer公司；N4 Plus亞微米粒度分析儀，美國(guó)Beckman Coulter公司；DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-250DE型數(shù)顯超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ZF-2型三用紫外儀，上海市安亭電子儀器廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 NLC的制備

采用熱高壓均質(zhì)法制備NLC[6]。分別稱取一定量的單硬脂酸甘油酯、中鏈甘油三酯、水性單甘脂、六聚甘油單硬脂酸酯，70℃混勻后加入白藜蘆醇和亞麻籽油，繼續(xù)攪拌至形成油相，將同溫度的去離子水和甘油混勻后邊攪拌邊加入到油相中，以上混合物繼續(xù)攪拌，最后通過(guò)預(yù)熱的高壓均質(zhì)機(jī)處理，高溫液體冷卻后得白藜蘆醇和亞麻籽油復(fù)配的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（RL-NLC）。

2.2 粒徑和PDI的測(cè)定

樣品稀釋后用N4 Plus亞微米粒度分析儀測(cè)量其粒徑分布，測(cè)量溫度25℃，測(cè)量角度90°，平衡時(shí)間10 min。

2.3 微觀形貌

樣品稀釋后滴在銅網(wǎng)上，用1%磷鎢酸水溶液負(fù)染，風(fēng)干后放在透射電鏡下觀察。

2.4 含量及包封率

繪制Res在307 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用紫外分光光度法測(cè)定Res的含量和包封率[7-8]。量取60 μL 樣品（RL-NLC），乙醇稀釋至25 mL，超聲破乳30 min后測(cè)得在307 nm處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出Res的含量W1。

包封率的測(cè)量方法為，分別取400 μL樣品于超濾離心管中，在10 000 r/min下離心20 min，收集300 μL濾液用乙醇稀釋至10 mL，在307 nm處測(cè)吸光度并計(jì)算出濾液中的Res含量W2，包封率（Encapsulation efficiency，EE）的計(jì)算公式為：

2.5 X射線衍射分析（XRD）

通過(guò)X射線衍射儀分別得到RL-NLC，Res以及GMS的XRD圖譜，X射線源使用銅陽(yáng)極（CuKa），并在40 kV、30 mA 下操作，掃描速度為0.02°/min，步長(zhǎng)為 0.15°，掃描范圍為 5°～60°。試驗(yàn)前對(duì)RL-NLC進(jìn)行冷凍干燥處理。

2.6 差示掃描量熱分析（DSC）

將GMS和RL-NLC置于鋁皿中，用空白鋁皿作對(duì)照，以5℃/min的速度從20℃加熱到90℃，得到升溫曲線。

2.7 體外模擬釋放

用透析袋法進(jìn)行體外模擬釋放研究，釋放介質(zhì)為水、吐溫 80和乙醇（80∶2∶20，V/V）[5]。白藜蘆醇乙醇溶液（R-Ethanol）為直接把Res溶解在乙醇中形成的液體。試驗(yàn)時(shí)將2 mL RL-NLC或REthanol樣品置于截留分子質(zhì)量為10 ku的經(jīng)浸泡處理的透析袋中，夾緊兩端，然后懸浮于盛有200 mL釋放介質(zhì)的燒杯中，37℃水浴條件下緩慢攪拌。分別在0.5，1，1.5，2，4，6，8，10，12和24 h 時(shí)，取出1 mL釋放介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)充1 mL同溫度的釋放介質(zhì)，稀釋并用0.45 μm膜過(guò)濾后檢測(cè)Res的含量，繪制Res的累積釋放曲線。

2.8 DPPH自由基清除活性

根據(jù)文獻(xiàn)中的方法來(lái)確定 RL-NLC、REthanol和L-NLC（無(wú)Res的亞麻籽油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體）的DPPH自由基清除能力[9-11]。將0.1 mL樣品和4 mL DPPH乙醇溶液（0.12 mmol/L）混勻，室溫避光下反應(yīng)30 min，測(cè)量反應(yīng)物在517 nm處的吸光度，計(jì)算DPPH清除百分比（Scavenging free radical percentage）：

式中，D代表DPPH清除百分比；AC代表對(duì)照反應(yīng)的吸光度；AS代表樣品反應(yīng)的吸光度。

2.9 脂質(zhì)的加速氧化試驗(yàn)

將等量RL-NLC和L-NLC密封放在50℃恒溫培養(yǎng)箱中，在第1，3，5，7，9天分析油脂的氧化情況。

2.9.1 脂質(zhì)的初級(jí)氧化產(chǎn)物 脂質(zhì)氫過(guò)氧化物是亞麻籽油中不飽和脂肪酸的初級(jí)氧化產(chǎn)物，本文根據(jù)Hanna Salminen等[12]的方法進(jìn)行氫過(guò)氧化物的評(píng)價(jià)。將0.2 mL樣品與1.6 mL異辛烷和異丙醇（3∶1，V/V）混合，振搖（10 s，3 次），離心取上層有機(jī)液0.2 mL，并加入到2.8 mL乙醇中，再加入20 μL 3.97 mol/L的硫氰酸銨溶液和20 μL亞鐵溶液（0.132 mol/L BaCl2與0.144 mol/L FeSO4等體積混合，離心取上清液），室溫下反應(yīng)20 min后測(cè)得510 nm處的吸光度。通過(guò)繪制的Fe3+標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算過(guò)氧化值（Peroxide value，PV）。

2.9.2 脂質(zhì)的次級(jí)氧化產(chǎn)物 脂質(zhì)的初級(jí)氧化產(chǎn)物易分解為醛、酮、酸等，其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的性質(zhì)穩(wěn)定，可以用來(lái)檢測(cè)脂質(zhì)被氧化的程度。丙二醛的含量用Sajid Maqsood等[13-14]所述方法測(cè)定。將0.2 mL待測(cè)樣品與4.8 mL TBA反應(yīng)液（0.375%硫代巴比妥酸，15%三氯乙酸和0.25 mol/L HCl溶液的混合液）混合搖勻，沸水加熱20 min以生成粉紅色液體，用自來(lái)水冷卻后，10 000 r/min下離心5 min，收集上清液，測(cè)532 nm 處的吸光度。根據(jù)繪制的 1，1，3，3-四甲氧基丙烷（丙二醛）標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）的濃度。

2.10 光照穩(wěn)定性

使用紫外燈評(píng)價(jià)Res的光照穩(wěn)定性[8]。將5 mL樣品等分成5份放在相同規(guī)格的透明玻璃瓶中，暴露在365 nm的紫外線下1 h，每隔15 min取出一份樣品，在307 nm處測(cè)其吸光度。

2.11 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

在相同時(shí)間間隔下（0，1，2，3月）對(duì)儲(chǔ)存在25℃避光環(huán)境中的RL-NLC進(jìn)行粒徑和包封率的測(cè)量，分析評(píng)價(jià)樣品的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

3 結(jié)果和討論

3.1 物理化學(xué)性質(zhì)的表征

測(cè)得RL-NLC的粒徑為104.9 nm±3.4 nm，PDI為0.216±0.025。PDI用于衡量顆粒的粒徑分布寬度，一般來(lái)說(shuō)，PDI越大，表示顆粒大小相差越大，PDI越小，表示顆粒大小越均一，該體系的PDI<0.3，說(shuō)明RL-NLC具有較窄的粒徑分布，均一性較好[15]。

RL-NLC的包封率與Res的生物利用度相關(guān)，包封率高的載體的應(yīng)用價(jià)值往往較高。RLNLC的包封率為98.4%±0.2%，說(shuō)明Res被很好地包裹在脂質(zhì)顆粒中。

3.2 形態(tài)表征

透射電鏡結(jié)果如圖1所示。大部分RL-NLC為規(guī)則的球形顆粒，粒徑在100 nm左右，沒(méi)有明顯的聚集現(xiàn)象，說(shuō)明RL-NLC具有很好的單分散性。

3.3 X射線衍射分析（XRD）

圖2為RL-NLC、GMS和Res的X射線衍射光譜，可以看出 Res在2θ=6.6°，16.4°，19.2°，22.3°，23.6°，28.3°處有很強(qiáng)的衍射峰，表明Res具有結(jié)晶性質(zhì)[9，15]，而RL-NLC中Res的這些峰消失了，這說(shuō)明Res是以無(wú)定形的形式存在于脂質(zhì)中或是溶解在脂質(zhì)中的。也可能有一些Res溶解在乳化劑中[15]。

長(zhǎng)鏈脂肪酸 GMS在2θ=19.6°和2θ=23.7°處分別表現(xiàn)出β型（三斜晶體結(jié)構(gòu)）和β′型（正交晶體結(jié)構(gòu)）晶體結(jié)構(gòu)的較強(qiáng)衍射峰，而制備的NLC在2θ=21.5°處也有衍射峰，這是α型（六邊形結(jié)構(gòu)）晶體結(jié)構(gòu)的特征，這是因?yàn)樵贜LC的冷卻過(guò)程中，GMS傾向于無(wú)序的α型晶體結(jié)構(gòu)[15]。隨著時(shí)間和溫度的變化，α型會(huì)經(jīng)由β'型轉(zhuǎn)變?yōu)棣滦?，但是NLC中液態(tài)脂質(zhì)的加入會(huì)阻礙脂質(zhì)的結(jié)晶[15]。

3.4 差示掃描量熱分析（DSC）

DSC可用于評(píng)價(jià)納米載體中脂質(zhì)的狀態(tài)。GMS在61.3℃處出現(xiàn)吸熱峰，而RL-NLC的升溫曲線中吸熱峰為41.5℃，這說(shuō)明在升溫過(guò)程中出現(xiàn)了固體脂質(zhì)的融化現(xiàn)象，由此證明RL-NLC中的脂質(zhì)基質(zhì)主要呈固態(tài)，具有脂質(zhì)納米粒的特征[15]。吸熱峰的移動(dòng)可以證明脂質(zhì)基質(zhì)中晶格缺陷的存在，這種晶格缺陷可能是由于液態(tài)脂質(zhì)的加入。

3.5 體外模擬釋放

體外模擬釋放研究一定程度上可以闡明Res的釋放機(jī)制。從圖4可看出NLC中Res的釋放速度比乙醇溶液中慢，24 h后，僅有60.6%±2.0%的Res從NLC中釋放出來(lái)，而乙醇溶液中釋放出的Res高達(dá)86.0%±3.1%。NLC中Res的釋放緩慢且持續(xù)，這說(shuō)明通過(guò)納米脂質(zhì)載體對(duì)Res進(jìn)行包裹后，延長(zhǎng)了Res的釋放時(shí)間，兩種溶液模擬釋放的差異可能跟RL-NLC的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，在脂質(zhì)基質(zhì)中的Res更不容易被釋放出來(lái)，因而具有持續(xù)和緩慢的特點(diǎn)。緩慢釋放能夠獲得較穩(wěn)定的藥物濃度，使藥物的有效作用時(shí)間得到延長(zhǎng)，從而提高其生物利用度[5]。

圖1 RL-NLC的透射電鏡圖Fig.1 The transmission electron microscopy of RL-NLC

圖2 RL-NLC、GMS和Res的XRD光譜Fig.2 XRD patterns of RL-NLC，GMS and Res

圖3 RL-NLC和GMS的DSC升溫曲線Fig.3 DSC melting curves of RL-NLC and GMS

圖4 RL-NLC和R-Ethanol 24 h的體外釋放曲線（n=3）Fig.4 In vitro release curves of RL-NLC and R-Ethanol

3.6 體外抗氧化活性分析

DPPH自由基清除法是一種簡(jiǎn)便且有效的用來(lái)評(píng)價(jià)體系抗氧化性能的方法。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（表1），Res乙醇溶液的抗氧化活性約為26.9%，而添加亞麻籽油并制成RL-NLC后，抗氧化活性增加到51.4%左右，無(wú)Res的亞麻籽油NLC（L-NLC）只有很小的抗氧化活性。該結(jié)果說(shuō)明，Res和亞麻籽油可能具有協(xié)同增效作用。

表1 3種樣品的DPPH清除百分比（n=3）Table 1 DPPH radical scavenging activity of three samples（n=3）

3.7 脂質(zhì)的加速氧化試驗(yàn)

本文研究了3種體系的亞麻籽油抗氧化能力，即無(wú)Res的亞麻籽油水包油乳液（L-NE）、無(wú)Res的亞麻籽油NLC（L-NLC）與白藜蘆醇和亞麻籽油復(fù)配的NLC（RL-NLC）。脂質(zhì)初級(jí)氧化產(chǎn)物（PV）和脂質(zhì)次級(jí)氧化產(chǎn)物（TBARS）的含量如圖5和圖6所示。試驗(yàn)伊始，3種體系的PV值相近，而隨著時(shí)間的增加，PV值呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，但是3種體系的差距已顯現(xiàn)出來(lái)：同一天的PV值L-NE＞L-NLC＞RL-NLC，并且Blank-NE的漲幅比其它兩種大。第1天時(shí)，L-NE的TBARS值小于L-

圖5 50℃儲(chǔ)存期間的脂質(zhì)初級(jí)氧化產(chǎn)物濃度（n=3）Fig.5 Concentrations of primary oxidation products during storage at 50℃（n=3）

3.8 光照穩(wěn)定性

在紫外光的照射下，正常情況下的反式Res會(huì)向順式Res轉(zhuǎn)變，這一轉(zhuǎn)變可能會(huì)降低Res的生物活性，如自由基清除活性和抗炎活性等[8]。本文將制備的RL-NLC和R-Ethanol分別暴露在紫外燈下1 h，每隔15 min測(cè)出剩余的Res含量，該值與0 min時(shí)的白藜蘆醇含量相比得到剩余的反式Res百分比。由圖7可以看出，1 h后RL-NLC中的反式Res含量為85.0%±0.4%，而R-Ethanol中僅剩余68.4%±0.8%，這說(shuō)明本文制備的RLNLC對(duì)Res具有保護(hù)作用，能延緩Res的降解。

3.9 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

25℃下密封避光儲(chǔ)存3個(gè)月后，RL-NLC的粒徑、PDI及包封率如表2所示。RL-NLC的粒徑為100 nm左右，并且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而輕微增大，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。在儲(chǔ)存過(guò)程中，粒徑和PDI的增加可能是由于顆粒間的相互碰撞、聚合。NLC的值，這可能是由于制備NLC時(shí)的加熱處理造成少量的亞麻籽油被氧化。第3天之后的TBARS值表現(xiàn)出和PV值相似的大小規(guī)律，并且L-NLC和RL-NLC的TBARS值幾乎沒(méi)有變化。

總而言之，3種體系中亞麻籽油的抗氧化能力表現(xiàn)為L(zhǎng)-NE＜L-NLC＜RL-NLC，造成這種結(jié)果的原因可能是：NLC中的脂質(zhì)被GMS固化，形成亞麻籽油的保護(hù)殼，因而具有更好的穩(wěn)定性，而水包油乳液中的脂質(zhì)為液態(tài)更容易被氧化；Res發(fā)揮了其作為抗氧化劑的效果，能有效抑制亞麻籽油的氧化[14]。包封率在3個(gè)月后降低為90.5%±0.5%，這說(shuō)明雖然有少量的Res泄露到了水中，但是大部分Res仍被包裹著?？傊?，本文研究的RL-NLC可以在25℃避光條件下儲(chǔ)存3個(gè)月以上。

圖6 50℃儲(chǔ)存期間的脂質(zhì)次級(jí)氧化產(chǎn)物濃度（n=3）Fig.6 Concentrations of secondary oxidation products during storage at 50 ℃（n=3）

圖7 暴露在365 nm紫外光下1 h剩余的反式白藜蘆醇百分比（n=3）Fig.7 Percentage of remaining trans-resveratrol after direct exposure to UV-light at 365 nm for 1 h（n=3）

表2 RL-NLC的粒徑和PDI（n=3）Table 2 The particle size and PDI of RL-NLC（n=3）

4 結(jié)論

使用熱高壓均質(zhì)法成功制備出了白藜蘆醇和亞麻籽油復(fù)配的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，該體系具有良好的物理穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和緩慢釋放的特點(diǎn)。DPPH自由基清除試驗(yàn)的結(jié)果證明了白藜蘆醇的抗氧化活性和亞麻籽油對(duì)它的促進(jìn)作用。此外，脂質(zhì)的加速氧化研究中發(fā)現(xiàn)，NLC的固態(tài)核結(jié)構(gòu)抑制了亞麻籽油的氧化，并且白藜蘆醇的抗氧化作用顯著。本文研究的白藜蘆醇和亞麻籽油載體，在功能食品領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。