唐玥雯 楊汝春* 萬鳳 張華琴 王軍 林宜

局灶節(jié)段性腎小球硬化（Focal and segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）是一類常見的原發(fā)性腎小球疾病，其治療困難且預(yù)后較差，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭（End-stage renal disease，ESRD）的主要原因之一［1-2］。前期研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過抑制腎臟炎癥因子的表達(dá)來緩解腎臟局灶節(jié)段性腎小球硬化［3］。而子宮內(nèi)膜干細(xì)胞（MenSC）是一群來源廣泛，具有自我更新、多向分化和高度增殖潛能的干細(xì)胞，有望成為良好的移植細(xì)胞源［4］。2017年1月至2019年3月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，探討MenSC移植對緩解FSGS大鼠進(jìn)程的影響，及其對腎組織炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：040505）；氯胺酮（福建古田藥業(yè)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；兔抗大鼠TNF-α抗體和兔抗大鼠IL-6抗體，購于武漢博士德生物工程有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA、山羊血清、羊抗兔HRP二抗、DAB顯色液及抗原修復(fù)液（上海邁新生物技術(shù)有限公司）；SYBR? Premix Ex TaqTM、ROX Reference Dye（50×）、引物設(shè)計(jì)及合成等均自TaKaRa公司。日立7180型全自動生化分析儀（日本株式會社日本高新技術(shù)）；Real-time PCR儀（ABI 7500）；低溫低速離心機(jī)（Heraeus，LEGENTRT，德國）；制冰機(jī)（Scotsman，AF100，意大利）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞 大鼠選用3周齡雌性，體重160～180g，清潔級SD大鼠，大鼠購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。動物質(zhì)量合格證號為SCXK（滬）2007-0005。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度20±1℃，濕度50%～60%，光照每12h明暗交替，通風(fēng)8～15次/h。實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號：SYXK（浙）2003-0003。MenSC購于杭州易文賽生物技術(shù)有限公司子宮內(nèi)膜干細(xì)胞庫，是從健康成年女性月經(jīng)血中分離得到的一種新來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.3 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MenSC細(xì)胞，置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%融合時，采用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，按1∶3的比例進(jìn)行傳代。（2）FSGS大鼠模型建立：將健康雌性SD大鼠稱重后隨機(jī)分為正常組、模型組和移植組，每組各6只。模型組及移植組大鼠先采用50mg/kg氯胺酮腹腔注射，待其麻醉后行左腎摘除術(shù)，術(shù)后第7、28天分別尾靜脈注射5mg/kg和2mg/kg阿霉素。正常組大鼠麻醉后行假手術(shù)，術(shù)后同時間內(nèi)以等量生理鹽水進(jìn)行尾靜脈注射。（3）細(xì)胞移植：用胰酶消化生長狀態(tài)良好的P3～P5代MenSC，用PBS重懸后調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/ml。移植組于術(shù)后第28天尾靜脈注射MenSC細(xì)胞懸液1ml；正常對照組大鼠不作任何處理，模型組大鼠注射等量PBS作為對照。（4）血液和尿液標(biāo)本的收集及測定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，使用代謝籠法收集24h尿量，量取尿量，用生化儀常規(guī)測定尿蛋白，結(jié)合尿量計(jì)算24h尿蛋白；在術(shù)后8周末氯胺酮麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心后收集上層血清，生化儀測定血肌酐、尿素氮、血漿白蛋白等指標(biāo)。（5）Real-time：PCR擴(kuò)增：Trizol提取大鼠腎臟總RNA，取約2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行real-time熒光定量PCR，采用GAPDH作為內(nèi)參。TNF-α上游引物序列5'-GGCGTGTTCATCCGTTCT-3'，下游引物序列5'-CCACTACTTCAGCGTCTCG-3'，PCR擴(kuò)增片段201bp；IL-6上游引物序列5'-CCTTCTTGGGACTGATGT-3'， 下 游 引 物序 列 5'-TCCAGGTAGAAACGGAAC-3'，PCR擴(kuò)增片段267bp；GAPDH上游引物序列5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，PCR 擴(kuò) 增 片 段453bp。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×）10μl，上下游引物各 0.4μl，ROX Reference Dye（50×）0.4μl，DNA 模 板 2.0μl，ddH2O 6.8μl。 于 ABI PRISM 7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30s，繼以95℃ 5s，60℃ 31s共40個循環(huán)，數(shù)據(jù)以2-△△Ct表示。（6）免疫組化檢測腎組織中TNF-α和IL-6表達(dá)：處死大鼠后，取出部分腎組織，經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后制成3μm厚的石蠟切片。免疫組化檢測腎組織中TNF-α和IL-6表達(dá)的步驟如下：切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)、PBS洗滌、胰蛋白酶消化、PBS清洗，5%山羊血清封閉30min后加入兔抗大鼠一抗（TNF-α 1∶50；IL-61∶100），置于4℃冰箱中過夜；PBS洗滌后加增強(qiáng)劑，37℃放置30min，然后滴加羊抗兔HRP二抗，37℃放置45min；清水沖洗3次后DAB顯色至棕黃色陽性信號出現(xiàn)，清水阻斷，洗3～4次后蘇木素復(fù)染，脫水晾干封片。采用ImagePro plus6.0圖像采集及分析系統(tǒng)，每張切片（×400）光鏡下隨機(jī)采集5個不重疊視野，測量棕黃色陽性染色平均積分光密度（Integral Optical Density，IOD），取平均值作為每例切片的平均IOD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（s）表示，方差齊者，多組間采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MenSC移植對FSGS大鼠24h尿蛋白的影響 見表1。

表1 MenSC移植對FSGS大鼠24h尿蛋白水平的影響（s）

表1 MenSC移植對FSGS大鼠24h尿蛋白水平的影響（s）

注：與模型組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

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2.2 MenSC移植對FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影響 見表2。

表2 MenSC移植對FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影響（s）

表2 MenSC移植對FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影響（s）

注：與模型組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

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2.3 MenSC移植對FSGS大鼠TNF-α和IL-6轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響 見圖1。

圖1 RT-PCR法檢測大鼠腎組織TNF-α和IL-6的基因表達(dá)（n=6）

2.4 MenSC移植對FSGS大鼠TNF-α和IL-6蛋白水平表達(dá)的影響 見圖2、表3。

圖2 免疫組化染色檢測各組大鼠腎組織TNF-α 和IL-6的表達(dá)（IHC，×400）

表3 半定量分析免疫組化中腎組織TNF-α和IL-6表達(dá)（s）

表3 半定量分析免疫組化中腎組織TNF-α和IL-6表達(dá)（s）

注：與模型組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

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3 討論

FSGS是由多病因?qū)е碌?、以腎小球節(jié)段硬化為病理特征的一種疾病，是一種常見的、極易進(jìn)展為ESRD的腎小球疾病［5-6］。然而，目前對FSGS的治療主要依賴于激素和免疫抑制劑，這些只能從某種程度上延緩其發(fā)展。因此，亟待尋找一種安全、有效，能從根本上控制甚至逆轉(zhuǎn)FSGS 病程進(jìn)展的方法。

干細(xì)胞自我更新和分化為各種細(xì)胞的潛能及免疫調(diào)節(jié)作用，為FSGS的治療開辟新的希望。已有研究證明人臍帶血來源干細(xì)胞移植可緩解FSGS大鼠腎小球硬化的進(jìn)展，降低血清中IL-6和TNF-α的表達(dá)［7］。MenSC是一類存在于子宮內(nèi)膜基底層的成體干細(xì)胞，不僅易于獲取，且具有一般成體干細(xì)胞的自我更新、無限增殖和多向分化的潛能［8-9］。此外，其還具有較低的免疫源性，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用前景。但有關(guān)MenSC用于FSGS治療的研究少有報(bào)道。本資料結(jié)果顯示，結(jié)果顯示MenSC移植組后6+周24h尿蛋白、血肌酐及尿素氮較模型組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），提示MenSC可在一定程度上緩解FSGS的進(jìn)程。

多種慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展均與炎癥存在相關(guān)性，F(xiàn)SGS的發(fā)生也通常伴隨著炎癥的存在［10-12］。本資料測定了腎組織中炎癥關(guān)鍵因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞分泌，是細(xì)胞因子的關(guān)鍵成分，可引起免疫細(xì)胞的激活，誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生［13］。有研究表明TNF-α在阿霉素腎病大鼠模型形成中起重要作用［14］。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分。研究顯示IL-6參與多種慢性腎臟病的發(fā)生和發(fā)展［15］。其既可由淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞和B細(xì)胞等）分泌，也可由非淋巴細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等）分泌［16］。在本實(shí)驗(yàn)中，RT-PCR結(jié)合免疫組化結(jié)果顯示FSGS大鼠中TNF-α和IL-6的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)均較正常組明顯增高（P＜0.01），表明FSGS大鼠體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。然而，MenSC移植后TNF-α和IL-6的表達(dá)均具有一定程度的下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05），提示MenSC可阻斷炎癥細(xì)胞等對TNF-α和IL-6的分泌，進(jìn)一步減少由TNF-α和IL-6刺激產(chǎn)生的炎癥因子的生成，從而改善FSGS大鼠腎功能。

綜上所述，MenSC移植可緩解FSGS的進(jìn)程，其作用機(jī)制可能是通過抑制腎組織中炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。由于FSGS涉及到多種炎癥因子及細(xì)胞因子，致病機(jī)制復(fù)雜，有待于進(jìn)一步的深入研究。