朱偉 包素珍 姜濤 錢鈞 魏自太* 王彩云

肺癌作為全球常見的惡性腫瘤之一，已成為較多國家病死率最高的惡性腫瘤［1］。由于大部分肺癌患者在確診時已是晚期，或已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，錯過最佳的治療機會，故5年生存率＜15%［2］。因此如何阻止肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是研究者關(guān)注的重點。現(xiàn)代研究表明，肺癌的發(fā)生多與免疫力下降有密切關(guān)系。中藥復(fù)方針對氣虛證的治療不僅能在一定程度上改善患者的免疫功能，同時還可明顯抑制肺癌細胞增殖、侵襲及遷移等生物學(xué)行為能力的改變，從而有效改善腫瘤血管的生長狀態(tài)，抑制肺癌的進展［3］。本文通過觀察加味黃芪建中湯對脾虛Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Wnt1、QKI7及MMP2表達的影響，探討其治療脾氣虛證肺癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級C57BL/6小鼠50只，6～8周齡，體重（20±2）g，均為雌性，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證：SCXK（滬）2013-0016。實驗時間2017年8月至2018年3月。

1.2 藥物制備 加味黃芪建中湯組成：黃芪9g、白芍18g、桂枝9g、甘草6g、生姜10g、大棗10g、飴糖30g、浙貝母10g、白花蛇舌草30g、仙鶴草12g（由浙江中醫(yī)藥大學(xué)濱江門診部提供）。上述藥物經(jīng)水煎、過濾、濃縮、滅菌后制成湯劑（含生藥濃度為1mg/ml）。生大黃浸出液：生大黃300g，加入1800ml蒸餾水后攪拌混均，放入50℃的水浴箱中，攪拌1次/30min，6h后絞液去渣，再倒入負壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，用50℃水浴濃縮制成生大黃浸出液（含生藥濃度為1mg/ml）。上述制劑放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑及儀器 D-木糖標準品儲備液2ml×1支（批號：20161115，南京建成生物工程研究所）；標準品稀釋液10ml×1支（批號：20161002，南京建成生物工程研究所）；胃泌素放射免疫分析藥盒（批號：20161123，南京建成生物工程研究所）；兔抗小鼠 QKI7（一抗）（Merck-Millipore，批號：2900158）；兔抗小鼠Wnt1抗體（一抗）（CST，批號：324114-1）；兔抗小鼠MMP2抗體（一抗）（R&D，批號：0417041）；免疫組化Power Vision二步法試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公 司 ）；PBS 液：NaCl 185g、Na2HPO4.12H2O 58g、NaH2PO4.12H2O 3g、蒸饋水1L混勻。rTdT 緩沖液：Buffer 45μl、MIX 5μl、rTdT 1μl配 制 成 50μl rTdT緩沖液，避光。甲醇、蘇木精染液、伊紅染液（南昌雨露實驗器材有限公司）；液氮（杭州悅通氣體技術(shù)開發(fā)有限公司）；無水乙醇（上海生工生物工程有限公司）；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）；W-O恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）；P-250A-B型高速多功能粉碎機（浙江永康久品工貿(mào)有限公司）；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；HYC-118海爾醫(yī)用冷藏箱（山東青島海爾股份有限公司）；切片機（德國徠卡儀器有限公司）；自動組織包埋機（德國Microm International GmbH）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；5417R型離心機（德國艾本德股份公司）；NanoDrop 2000微量核酸蛋白檢測儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Bio-RADIQ5 Multicolor-Real-Time熒光定量PCR儀（Bio-RAD）。

1.4 模型建立及給藥 脾虛小鼠模型建立：將50只C57BL/6小鼠在動物實驗中心常規(guī)適應(yīng)飼養(yǎng)1周，隨機取30只，采用苦寒瀉下法+饑餓法+疲勞法建立脾氣虛模型。具體步驟：給予大黃濃縮液灌胃，1ml/（20g·d），分2次，同時每日游泳至力竭，并間隔1日節(jié)食，連續(xù)14d。從第3、4天起小鼠開始出現(xiàn)大便溏瀉；5d后出現(xiàn)不同程度的嗜臥、倦怠等癥狀。期間由于灌胃不當(dāng)及游泳溺水死亡3只。造模第15天，分別從正常和模型小鼠中隨機各取10只小鼠，稱重并眼球取血后，測血清D-木糖和胃泌素水平，以驗證脾虛模型成功。脾虛模型成功后，停止大黃灌胃。荷瘤小鼠模型建立：取傳代后第13天C57BL/6荷瘤小鼠（由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物研究中心提供），脫頸椎處死，在無菌條件下，對操作部位皮膚以酒精消毒，小鼠皮膚下剝?nèi)⌒迈r無壞死Lewis腫瘤組織，置于無菌平皿中；用消毒剪刀將腫瘤塊剪碎，加生理鹽水于研磨器中反復(fù)研磨，于200目篩網(wǎng)過濾，制成腫瘤細胞懸液；于顯微鏡下計算癌細胞數(shù)目，用生理鹽水將腫瘤細胞濃度調(diào)整為1×107個/ml；將正常組10只和脾虛組17只小鼠接種腫瘤，取上述腫瘤細胞懸液0.2ml，接種于小鼠右腋部皮下，采集腫瘤組織到最后一只小鼠接種完成控制在＜2h。在接種Lewis腫瘤組織后，隨機將實驗小鼠分為3組：①單純肺癌組（10只）：生理鹽水灌胃，1次/d，0.4ml/次；②脾虛肺癌組（8只）：生理鹽水灌胃，1次/d，0.4ml/次；③脾虛肺癌用藥組（9只）：中藥加味黃芪建中湯灌胃，1次/d，0.4ml/次；各組按以上方法給藥，連續(xù)15d后，進食不禁水12h，第16天脫頸椎處死小鼠。

1.5 觀察指標 小鼠眼眶取血0.4ml，分離血清后置于-80℃冰箱。比色法測定血清D-木糖含量，用Elisa法測定血清胃泌素水平，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。檢測腫瘤重量、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)：在處死小鼠后，無菌剝?nèi)∑は铝鰤K稱重；分離氣管，取出肺臟，浸入Bouin液固定后對肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)觀察計數(shù)。

1.6 RT-PCR檢測腫瘤組織Wnt1、QKI7含量 采用Trizol提取總RNA，微量核酸蛋白檢測儀測定濃度，取5μg總RNA，利用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程有限公司）逆轉(zhuǎn)錄為c-DNA，逆轉(zhuǎn)錄條件42℃，45min；70℃，10min后迅速置于冰上備用。引物由上海生工生物工程有限公司負責(zé)合成，以Wnt1為內(nèi)參，小鼠Wnt1上游引物：5'-CTACTGGCACTGACCGCTCT-3’，下游引物：5'-CTTGGAATCCGTCAACAGGT’，小鼠QKI7上游引物：5'-GCTGAAGAGAGCGGTTGAAG-3’，下游引物：5'-GCGTCTCTGTAGGTGCCATT-3’，反應(yīng)條件：95℃，3min；95℃，15s；56℃，20s，共40個循環(huán)，檢測熒光信號。每個樣品做3個平行管，各個基因的相對表達水平以2-△△Ct進行統(tǒng)計分析。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中MMP2的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，切片入微波處理液，微波加溫90～98℃10min，冷卻后蒸餾水稍洗，3%雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶5min，PBS洗3次3min，滴加第一抗體置37℃孵育30min，PBS洗3次3min，滴加第二抗體置37℃孵育30min，PBS洗3次3min，DAB-H2O2顯色，流水沖洗，Mayers蘇木素復(fù)染細胞核1～2min；流水沖洗數(shù)分鐘，常規(guī)脫水封片。MMP2陽性表達均在胞核，呈現(xiàn)棕黃色顆粒，每張片在400倍視野下任意選取10個視野，每張片最少計數(shù)500個細胞，計算每一百個細胞中的陽性細胞數(shù)采用百分數(shù)計數(shù)法。MMP2陽性表達率=陽性表達數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料數(shù)以（s）表示，兩組間用t檢驗，多組間用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組與脾氣虛證模型組小鼠血清D-木糖和胃泌素水平比較 見表1。

表1 正常組和脾氣虛組小鼠D-木糖和胃泌素變化（s）

表1 正常組和脾氣虛組小鼠D-木糖和胃泌素變化（s）

注：與正常組比較，*P＜0.05

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2.2 肺癌組、脾虛肺癌組和脾虛肺癌用藥組小鼠皮下腫瘤重量及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較 見表2。

表2 各組腫瘤組織中瘤重及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)情況比較（s）

表2 各組腫瘤組織中瘤重及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)情況比較（s）

注：與單純肺癌組比較，*P＜0.05；與脾虛肺癌組比較，#P＜0.05

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2.3 各組腫瘤組織中Wnt1表達情況比較 見表3。

表3 各組腫瘤組織中Wnt1表達情況比較（s）

表3 各組腫瘤組織中Wnt1表達情況比較（s）

注：與肺癌對照組比較，*P＜0.05；與脾虛證肺癌組比較，#P＜0.01

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2.4 各組腫瘤組織中QKI7表達情況比較 見表4。

表4 各組腫瘤組織中QKI7表達情況比較（s）

表4 各組腫瘤組織中QKI7表達情況比較（s）

注：與肺癌對照組比較，*P＜0.05；與脾虛證肺癌組比較，#P＜0.01

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2.5 各組腫瘤組織中MMP2陽性表達率比較 見表5、圖 1～3。

表5 各組腫瘤組織中MMP2陽性表達率比較（s）

表5 各組腫瘤組織中MMP2陽性表達率比較（s）

注：與肺癌對照組比較，*P＜0.05；與脾虛證肺癌組比較，#P＜0.01

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圖1 單純肺癌組MMP2的陽性表達

圖2 脾虛肺癌組MMP2的陽性表達

圖3 脾虛肺癌用藥組MMP2的陽性表達

3 討論

腫瘤微環(huán)境（TME）主要是由基質(zhì)細胞和腫瘤細胞組成，TME包含巨噬細胞和淋巴細胞等免疫細胞、構(gòu)成血管的細胞、脂肪細胞、成纖維細胞和細胞外基質(zhì)（ECM）等。而在這些細胞中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境（TME）中最重要的組成部分，其能夠促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。Wnt1作為Wnt家族中的一員，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義［4］。Wnt1可通過合成特殊的RNA和蛋白質(zhì)，進入細胞核促進細胞DNA復(fù)制，促進細胞分裂增殖。Wnt1可作為評價肺癌患者預(yù)后的一個重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白QKI與低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）對腫瘤細胞的細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生以及細胞周期均有重要的調(diào)控作用，且與預(yù)后相關(guān)［5］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）是一組由結(jié)締組織細胞分泌的、參與細胞外基質(zhì)構(gòu)成的蛋白酶家族，MMP2是MMPS家族的一員，大量研究表明，MMP2在多種腫瘤組織中呈過度表達，與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。

本實驗加味黃芪建中湯為黃芪建中湯加白花蛇舌草、仙鶴草、浙貝三味中藥，白花蛇舌草主要功效是清熱解毒、消癰散結(jié)、利尿除濕。臨床常應(yīng)用白花蛇舌草配方治療各種癌癥。仙鶴草具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒等功效，研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草還具有較強的抗癌功效。浙貝歸肺、心經(jīng)，主要功效為清熱化痰、降氣止咳、散結(jié)消腫。浙貝母堿是中藥浙貝母的主要成分，近年來其抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)耐藥的作用逐漸得到認同。在補脾基礎(chǔ)上，加強抗腫瘤功效。

本資料中，造模后脾虛小鼠血清D-木糖和胃泌素水平較正常組明顯下降，并且小鼠出現(xiàn)納少、便溏、成群蜷縮、四肢乏力、體重下降等脾虛典型癥狀。對模型組小鼠接種Lewis腫瘤后，瘤體較單純肺癌組明顯增大，RT-PCR結(jié)果顯示在脾虛肺癌小鼠中Wnt1、MMP2的表達較單純肺癌組明顯升高，QKI7的表達明顯降低。而經(jīng)過加味黃芪建中湯治療后，小鼠瘤體較脾虛肺癌組明顯減小，相對單純肺癌組也有縮小的趨勢，提示加味黃芪建中湯對脾虛證肺癌有較好的療效，同時Wnt1、MMP2的表達有明顯下降，而QKI7的表達明顯升高。表明加味黃芪建中湯可通過調(diào)節(jié)QKI7、Wnt1及MMP2的表達，抑制脾虛證Lewis肺癌腫瘤細胞增殖的作用。