李倩 黃國(guó)強(qiáng)*

乳腺癌是女性常見的癌癥之一，在我國(guó)女性中乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，研究顯示每年我國(guó)女性新發(fā)乳腺癌患者達(dá)27萬左右［1］，其中約有3%～8%左右的乳腺癌患者初診時(shí)已經(jīng)轉(zhuǎn)移［2］，嚴(yán)重威脅女性生命健康和生活質(zhì)量。microRNAs（miRNAs）是一種負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA，與腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。最近研究表明，miRNA結(jié)合位點(diǎn)中的單核苷酸多態(tài)影響miRNAs的調(diào)控作用，影響相關(guān)基因的表達(dá)水平，增加疾病的風(fēng)險(xiǎn)［4］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PALLD基因rs1071738位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，rs1071738位點(diǎn)位于PALLD基因的3'-UTR處，該位置是miR-96和miR-182的靶點(diǎn)位置。本文探討血漿miR-96和miR-182水平及PALLD基因rs1071738位點(diǎn)SNP與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)以及進(jìn)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年10月至2017年12月本院收治的乳腺癌患者150例為觀察組，乳腺癌的診斷是2位病理醫(yī)師根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）《乳腺病理組織學(xué)分類》（2012年版）［5］標(biāo)準(zhǔn)讀片確認(rèn)其病理類型，其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌100例，浸潤(rùn)性小葉癌45例，其它類型癌5例；年齡38～58歲，平均年齡（48.50±8.52）歲。身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（24.15±3.52）kg/m2；雌激素受體（ER）陽性45例，孕激素受體（PR）陽性39例；TNM分期Ⅰ期52例，Ⅱ期32例，Ⅲ期37例，Ⅳ期29例。同期根據(jù)觀察組患者的年齡配對(duì)選擇體檢健康的婦女150例為對(duì)照組，年齡40～63歲，平 均（48.72±10.15） 歲，BMI（24.22±3.75）kg/m2。排除有其它部位腫瘤的患者、免疫系統(tǒng)疾病的患者。兩組年齡、BMI等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 PALLD基因分型檢測(cè) 取血漿約5ml，EDTA抗凝后血漿用于RNA抽提，血細(xì)胞用于基因組DNA提 取。 使 用 QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN，Gaithersburg，MD）試劑盒提取基因組DNA，設(shè)計(jì)PALLD基因rs1071738位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物后由金唯智生物科技有限公司合成，其中上游引物序列為5'-AAC CGA GCA GGA CAG AAC-3'；下游引物序列為5'-TGG TGG CAC TCC CAA TAC-3'。以提取的基因組DNA為模板，使用PCR擴(kuò)增試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析PALLD基因rs1071738位點(diǎn)基因型。

1.3 miR-96和miR-182測(cè)定方法 取分離的血漿，使用Trizol（Invitrogen）抽提總RNA，用miRNease Mini kit（QIAGEN，Gaithersburg，MD）進(jìn)行分離。為了去除任何對(duì)基因組或質(zhì)粒DNA的污染，使用RQ1 RNase-free DNase（Promega，Madison，WI）進(jìn)行處理。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)處理后的RNA樣品中miR-96和miR-182的表達(dá)量，使用的試劑盒是 TaqMan miRNA assay（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA），內(nèi)參為RNU6B，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（s），采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以［n（%）］表示，用χ2檢驗(yàn)。使用χ2檢驗(yàn)分析基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用非條件Logistic回歸分析計(jì)算比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI），分析不同基因型與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PALLD基因rs1071738位點(diǎn)基因型和等位基因頻率 PALLD基因rs1071738位點(diǎn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。觀察組患者與對(duì)照組PALLD基因rs1071738位點(diǎn)基因型頻率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=31.589，P＜0.001），以野生型（GG）作為參考，雜合子（GC）和純合子（CC）均是乳腺癌的保護(hù)因素（OR=0.140，95%CI：0.058～0.329，P＜0.001；OR=0.240，95%CI：0.050～0.098，P=0.024）。觀察組患者C等位基因頻率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=31.582，P＜0.001），以G等位基因?yàn)閰⒖?，C等位基因是乳腺癌的保護(hù)因素（OR=0.200，95%CI：0.104～0.379，P＜0.001），見表 1。

表1 PALLD基因rs1071738位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)［n（%）］

2.2 PALLD基因rs1071738位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌分期的相關(guān)性 合并TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期以及Ⅲ與Ⅳ期，分析PALLD基因rs1071738位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與不同TNM分期的相關(guān)性，結(jié)果顯示不同基因型患者TNM分期的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.871，P=0.015），以野生型為參考，突變型乳腺癌患者進(jìn) 展 期 的 較 少（OR=0.114，95%CI：0.005～0.904，P=0.015），見表 2。

表2 PALLD基因rs1071738位點(diǎn)基因多態(tài)性與乳腺癌患者TNM分期相關(guān)性

2.3 血漿miR-96和miR-182水平 采用RT-PCR檢測(cè)所有受試者血漿miR-96和miR-182水平，結(jié)果顯示乳腺癌患者血漿中miR-96和miR-182水平顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 血漿miR-96和miR-182水平比較

2.4 血漿miR-96和miR-182水平與乳腺癌分期的相關(guān)性 分析乳腺癌患者不同TNM分期與血漿miR-96和miR-182水平之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示Ⅰ、Ⅱ期患者血漿miR-96和miR-182水平顯著高于Ⅲ、Ⅳ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。

圖2 不同TNM分期的乳腺癌患者血漿miR-96和miR-182水平

2.5 PALLD基因rs1071738位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與血漿miR-96和miR-182水平的關(guān)系 分析PALLD基因rs1071738位點(diǎn)不同基因型受試者血漿miR-96和miR-182水平，結(jié)果顯示，野生型受試者血漿miR-96和miR-182水平顯著低于突變型受試者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A。分析乳腺癌患者血漿miR-96和miR-182水平與PALLD基因rs1071738位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示野生型乳腺癌患者血漿miR-96和miR-182水平顯著低于突變型乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

圖3 PALLD基因rs1071738位點(diǎn)基因多態(tài)性與血漿miR-96和miR-182水平相關(guān)性。A圖為所有受試者血漿miR-96和miR-182水平，B為乳腺癌患者中血漿miR-96和miR-182水平。

3 討論

乳腺癌早期診斷和檢測(cè)是其篩查的主要方式。目前的常規(guī)篩選試驗(yàn)由于假陽性結(jié)果而具有危險(xiǎn)性或不可靠性，因此需要鑒定用于乳腺癌的可靠和早期檢測(cè)的新型非侵入性或微創(chuàng)生物標(biāo)志物?；隗w液的microRNA為早期檢測(cè)乳腺癌提供極好的非侵入性診斷工具［6-9］。近年來，microRNA的表達(dá)改變被認(rèn)為是包括乳腺癌在內(nèi)的各種癌癥中最可靠的診斷生物標(biāo)志物［10］。

PALLD基因起始位點(diǎn)和選擇性剪接導(dǎo)致該基因編碼多個(gè)亞基，其亞基參與細(xì)胞的遷移，尤其是乳腺癌細(xì)胞的遷移［11］。通過細(xì)胞外基質(zhì)降解與細(xì)胞骨架［11］的連接、調(diào)節(jié)胞漿體和胞壁凸出形成［12-13］等多種機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)。PALLD基因表達(dá)的Palladin蛋白與miR-96和miR-182表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，Palladin表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［14］。本資料結(jié)果顯示，在乳腺癌患者血漿中的miR-96和miR-182水平顯著低于健康對(duì)照組，筆者認(rèn)為乳腺癌患者血漿中miR-96和miR-182水平低，Palladin蛋白水平較高，而高水平的Palladin蛋白參與對(duì)于細(xì)胞的遷移和侵襲活動(dòng)具有促進(jìn)作用。本資料中Ⅲ期和Ⅳ期乳腺癌患者血漿中miR-96和miR-182水平低，同理Palladin蛋白水平較高，細(xì)胞的遷移和侵襲活動(dòng)較強(qiáng)。

本資料結(jié)果顯示，攜帶突變型C等位基因的群體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)低于野生型等位基因（G）攜帶者，且突變型乳腺癌患者進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)較低。野生型患者血漿miR-96和miR-182水平顯著低于突變型，作者推測(cè)C等位基因與miR-96和miR-182能夠更好的結(jié)合，使miR-96和miR-182能夠更好的發(fā)揮調(diào)控作用，顯著降低Palladin蛋白的表達(dá)，降低乳腺癌的發(fā)生率和乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。然而，有研究者認(rèn)為miR-96在乳腺癌中具有促癌作用，如有研究者發(fā)現(xiàn)miR-96可能通過調(diào)節(jié)ABCA1抑制細(xì)胞凋亡，從而在乳腺癌中發(fā)揮致癌作用［15］。Hong等［16］研究認(rèn)為miR-96可通過沉默PTPN9促進(jìn)乳腺腫瘤發(fā)生，對(duì)于不同研究結(jié)果作者認(rèn)為miR-96在機(jī)體內(nèi)的靶點(diǎn)并不唯一，通過不同靶點(diǎn)作用可能產(chǎn)生不同的調(diào)控結(jié)果。

綜上所述，PALLD基因rs1071738位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)展相關(guān)，可能機(jī)制是PALLD基因rs1071738位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性影響miR-96和miR-182的調(diào)控作用。