內生真菌司氏角擔子菌B6對尖孢鐮刀菌西瓜?；途甑霓卓棺饔?/h1>
2019-10-12 07:20:52劉付燕劉連紅郝思靜王興祥戴傳超
微生物學雜志 2019年4期
劉付燕，劉連紅，郝思靜，王興祥，戴傳超*
(1.南京師范大學生命科學學院/江蘇省微生物資源產業(yè)化工程技術研究中心 江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室，江蘇 南京 210046；2.中國科學院南京土壤研究所 土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，江蘇 南京 210008；3.中國科學院 紅壤生態(tài)實驗站，江西 鷹潭 335211)
西瓜(Citrulluslanatus)是世界十大水果之一，具有清熱解毒功效。近年來，西瓜栽培面積不斷擴大但產量不高，究其原因是輪作土壤種植西瓜會產生枯萎病害造成其嚴重減產[1-2]。西瓜枯萎病的病原菌主要是尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.Niveum，F(xiàn)ON)，它的存在形式以菌核、厚垣孢子或菌絲體為主，該菌在土壤或未腐熟的帶菌有機肥中存活時限長達8～10年之久，很難根除[3-4]。因此，防治西瓜枯萎病的關鍵措施是抑制尖孢鐮刀菌的生長。目前，防治西瓜枯萎病的方法有化學農藥法、西瓜嫁接栽培、間作套作等[5-8]?；瘜W農藥方法雖然效果顯著，但持續(xù)使用易造成病菌產生抗性、農藥殘留影響環(huán)境和人體健康；間作套作相對污染小，但受到的影響因素較多(如當?shù)氐姆N植習慣等)，不利于推廣。近年來，使用有益微生物與FON發(fā)生拮抗作用來抑制其生長和繁殖，從而有效地控制西瓜枯萎病的發(fā)生，其生物防治方法得到普遍推廣[9-12]。例如，張麗萍等[13]研究T42木霉與枯草芽胞桿菌Bs-6的混合菌劑對FON的拮抗作用，結果顯示西瓜的品質得到了很大的提高，病害率降低了75%。但是工業(yè)化的木霉制劑多為活孢子，穩(wěn)定性差不利于投入到田間試驗。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)篩選分離自重陽木莖內皮的內生真菌B6[14]作為生物菌劑具有抗蟲、抑菌及降解菲[15-16]等功能，將B6添加到西瓜連作土壤中發(fā)現(xiàn)FON病原菌數(shù)量減少了29.9%[17]，但是內生真菌B6抑制FON的作用機制尚未闡明。本研究以內生真菌B6和FON為材料，采用對峙培養(yǎng)和抑菌實驗的方法探究內生真菌B6與FON之間的拮抗作用及其揮發(fā)性物質對FON生長和產孢的影響，為進一步探究西瓜枯萎病生物防治技術提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 供試菌株 內生真菌司氏角擔子菌(Ceratobasidumstevensii)B6是本課題組自重陽木莖內皮分離得到的，菌種保藏于江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室。尖孢鐮刀菌西瓜?；途?Fusariumoxysporumf.sp.Niveum，F(xiàn)ON)分離自1株患枯萎病的西瓜苗，此患病西瓜苗采自中國農業(yè)科學院祁陽紅壤試驗站連作西瓜實驗田。
1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g(液體培養(yǎng)基無需添加)。B6和FON菌株使用馬鈴薯固體或液體培養(yǎng)基(PDB)28 ℃培養(yǎng)3 d進行活化，備用。
1.2 方法
1.2.1 B6和FON的拮抗培養(yǎng)[18]使用打孔器分別打取直徑5 mm的B6和FON菌塊，再接種到新的PDA平板上，B6和FON間距為3 cm，平板正置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。
1.2.2 顯微鏡下觀察B6和FON菌絲之間的相互作用 按照1.2.1方式打取菌塊，同時在距離FON 1 cm處鋪一張無菌玻璃紙條(1 cm×5 cm)，28 ℃培養(yǎng)，當兩菌菌絲均長到玻璃紙上且發(fā)生相互接觸時，揭下玻璃紙，顯微鏡下觀察[19]。選取未放玻璃紙條的平板，培養(yǎng)15 d后，在兩菌交界處打取5 mm菌塊，組織勻漿器將其破碎，加無菌水混勻澄清后取1 mL上清液平板涂布后倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌絲的生長狀況。
1.2.3 B6無菌發(fā)酵液對FON生長和產孢的影響 選取PDB中培養(yǎng)15 d的菌株B6于5 000 r/min離心10 min獲得上清液，上清液用3層濾紙抽濾，0.22 μm濾膜過濾除菌。分別取2、5、10 mL發(fā)酵原液加入8、5、0 mL無菌水，得到稀釋倍數(shù)分別為5倍、2倍和原液的10 mL發(fā)酵液，再添加90 mL PDB與其混合均勻，然后倒平板冷卻凝固后接入5 mm FON菌塊，28 ℃培養(yǎng)7 d。先測量菌落直徑，再于培養(yǎng)皿中加入3 mL無菌水，用涂棒均勻涂布得孢子懸液，血球計數(shù)板測孢子數(shù)量。以10 mL無菌水添加90 mL PDB的平板作為對照，每個處理3個重復。
生長抑制率(%)=((對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑)×100
產孢抑制率(%)=((對照組產孢量-處理組產孢量)/對照組產孢量)×100
1.2.4 B6揮發(fā)性物質對FON生長、產孢及其菌絲形態(tài)的影響 打取1個FON菌塊和3個B6菌塊，分別接種到2個PDA平板上，一種是直接將2個平板的皿底相扣[20]，另一種是在距離FON菌塊1 cm處鋪一張無菌玻璃紙條(1 cm×5 cm)[19]。兩者用封口膜封好后保持FON的皿底向上于28 ℃培養(yǎng)7 d。前者測量FON菌落直徑，然后在接種FON的培養(yǎng)皿中加入3 mL無菌水，均勻涂布，得孢子懸液，血球計數(shù)板測量孢子數(shù)量。后者取出玻璃紙條用于顯微鏡觀察FON菌絲的變化。以未接B6菌塊的平板作為對照。
2 結果與分析
2.1 B6和FON的拮抗培養(yǎng)
圖1中a～b顯示，開始時兩種菌獨立生長，F(xiàn)ON菌落呈紫色，B6菌落呈淡黃色；c～d顯示B6生長較快，當培養(yǎng)到第3天時，兩菌菌絲接觸，接觸區(qū)域FON停止生長，B6在FON菌絲表面繼續(xù)生長，直到將FON完全覆蓋；e～h顯示，從平板底面觀察發(fā)現(xiàn)B6覆蓋區(qū)域FON紫色變成淡黃色，后又漸變成白色，當B6將FON完全覆蓋后，紫色完全消失。
圖1 B6和FON的對峙培養(yǎng)Fig.1 The dual culture of B6 and FONa～d：B6和FON培養(yǎng)3 d菌落正面；e～h：菌落反面a-d：the front colony maps of B6 and FON culture for 3 days；e-h：the negative colony maps
2.2 B6菌絲和FON菌絲之間的相互作用
圖2b中，可以發(fā)現(xiàn)B6菌絲在向外生長的過程中不斷分支，且分支與其生長主方向幾乎是垂直的，分支與附近的菌絲相接，為其他菌絲的生長提供支架作用，如此繼續(xù)形成復雜的網絡結構。c和d中，箭頭指示B6菌絲的分支形成附著胞似的結構附著到FON菌絲上繼續(xù)向外生長，可見其具有很強的競爭能力。e是B6菌絲頂端部位的放大，可以看到其頂端周圍有黑色物質，推測B6可能是通過這種物質識別周圍可供其附著的固定點，從而決定其分支生長的方向，利于其競爭生存空間。
將兩菌交界處打取的菌塊磨碎涂平板，培養(yǎng)3 d后平板上同時長出白色和紫色菌絲，即B6和FON的菌絲，這說明B6將FON完全覆蓋后并不會引起其菌絲死亡，只是通過競爭生存空間和營養(yǎng)物質而限制其生長。
2.3 B6無菌發(fā)酵液對FON生長和產孢的影響
與對照相比，培養(yǎng)基中加入B6無菌發(fā)酵液并沒有抑制FON的生長和產孢，反而在一定程度上對其生長和產孢有促進作用(表1)。
圖2 對峙培養(yǎng)中B6菌絲和FON菌絲之間的相互作用Fig.2 The interaction of B6 and FON in the dual culturea：FON菌絲；b：B6菌絲；c～d：B6菌絲的分支附著到FON菌絲；e：B6菌絲頂端部位a：FON；b：B6；c-d：B6 attached FON；e：the top part of B6
表1 B6無菌發(fā)酵液對FON菌落生長和產孢量的影響Table 1 The effect of sterile fermentation broth of B6 on the grow and sporulation of FON
2.4 B6揮發(fā)性物質對FON生長和產孢的影響
與單獨培養(yǎng)FON相比，對峙培養(yǎng)中B6產生的揮發(fā)性物質可以不同程度地抑制FON的生長和產孢，抑制率分別為20.9%和30.9%(表2)。
表2 B6揮發(fā)性物質對FON菌落生長和產孢量的影響Table 2 The effect of volatile substance of B6 on the grow and sporulation of FON
圖3 B6揮發(fā)性物質對FON菌絲形態(tài)的影響Fig.3 The effect of volatile substance of B6 on mycelial morphology of FON
與單獨培養(yǎng)的FON菌絲形態(tài)相比，B6和FON對峙培養(yǎng)時，F(xiàn)ON菌絲分枝變少(圖3)。B6產生的揮發(fā)性物質可能正是通過抑制FON的菌絲分支形成和降低FON菌絲生長速率來抑制FON的生長和產孢，這與前面的結果是一致的。
3 討 論
競爭、抗生和重寄生是內生真菌與病原菌之間的主要作用方式[21]。對峙培養(yǎng)試驗表明，B6具有很強的競爭能力，能夠在對峙培養(yǎng)中占據(jù)培養(yǎng)皿的大部分空間，最終完全覆蓋FON。紀明山等[22]在綠色木霉和尖孢鐮刀菌的對峙培養(yǎng)試驗中也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，綠色木霉菌絲能夠緊貼尖孢鐮刀菌菌絲平行生長或穿入菌絲生長，從而競爭尖孢鐮刀菌的生存空間使其菌絲解體。另外，Audrey等[23]研究了內生真菌Paraconiothyriumvariabile與Fusariumoxysporum的對峙培養(yǎng)，PV也會造成FO細胞的解體死亡。在顯微鏡下觀察B6和FON的菌絲相互作用，發(fā)現(xiàn)FON菌絲的外圍附著B6菌絲，可能是B6通過分泌某些物質識別FON菌絲來實現(xiàn)的，然而B6菌絲不會造成FON菌絲的斷裂和解體。進一步的實驗結果也證明雖然B6可以將FON完全覆蓋，但并不能導致其完全死亡。這些實驗結果表明，內生真菌B6和FON的相互作用機制僅僅是競爭，而不存在重寄生作用。
植物內生真菌與病原菌可在宿主體內進行相互競爭，主要是空間和營養(yǎng)[24-25]，前者能夠釋放各種具有抑菌活性的成分來抵御病原菌。通過對B6次級代謝產物的抑菌活性進行研究，發(fā)現(xiàn)B6發(fā)酵液并不能抑制FON的生長和產孢，而B6揮發(fā)性物質表現(xiàn)出抑菌活性，結果顯示其對FON生長抑制率為20.9%，產孢抑制率為30.9%。這表明B6與FON拮抗作用是揮發(fā)性代謝產物所致。例如，Angela等[26]發(fā)現(xiàn)菠蘿的1株內生真菌(Muscodorcrispans)能夠產生混合的揮發(fā)性物質，這些物質對許多植物和動物病原菌表現(xiàn)出廣譜殺菌性[27-28]，主要包括酯類、醇類和酸類。推測B6的揮發(fā)性物質不是單一存在的，有可能是幾種物質的混合，混合物的種類和結構成分的確定還需進一步探究。
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劉付燕，劉連紅，郝思靜，王興祥，戴傳超*
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西瓜(Citrulluslanatus)是世界十大水果之一，具有清熱解毒功效。近年來，西瓜栽培面積不斷擴大但產量不高，究其原因是輪作土壤種植西瓜會產生枯萎病害造成其嚴重減產[1-2]。西瓜枯萎病的病原菌主要是尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.Niveum，F(xiàn)ON)，它的存在形式以菌核、厚垣孢子或菌絲體為主，該菌在土壤或未腐熟的帶菌有機肥中存活時限長達8～10年之久，很難根除[3-4]。因此，防治西瓜枯萎病的關鍵措施是抑制尖孢鐮刀菌的生長。目前，防治西瓜枯萎病的方法有化學農藥法、西瓜嫁接栽培、間作套作等[5-8]?；瘜W農藥方法雖然效果顯著，但持續(xù)使用易造成病菌產生抗性、農藥殘留影響環(huán)境和人體健康；間作套作相對污染小，但受到的影響因素較多(如當?shù)氐姆N植習慣等)，不利于推廣。近年來，使用有益微生物與FON發(fā)生拮抗作用來抑制其生長和繁殖，從而有效地控制西瓜枯萎病的發(fā)生，其生物防治方法得到普遍推廣[9-12]。例如，張麗萍等[13]研究T42木霉與枯草芽胞桿菌Bs-6的混合菌劑對FON的拮抗作用，結果顯示西瓜的品質得到了很大的提高，病害率降低了75%。但是工業(yè)化的木霉制劑多為活孢子，穩(wěn)定性差不利于投入到田間試驗。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)篩選分離自重陽木莖內皮的內生真菌B6[14]作為生物菌劑具有抗蟲、抑菌及降解菲[15-16]等功能，將B6添加到西瓜連作土壤中發(fā)現(xiàn)FON病原菌數(shù)量減少了29.9%[17]，但是內生真菌B6抑制FON的作用機制尚未闡明。本研究以內生真菌B6和FON為材料，采用對峙培養(yǎng)和抑菌實驗的方法探究內生真菌B6與FON之間的拮抗作用及其揮發(fā)性物質對FON生長和產孢的影響，為進一步探究西瓜枯萎病生物防治技術提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 供試菌株 內生真菌司氏角擔子菌(Ceratobasidumstevensii)B6是本課題組自重陽木莖內皮分離得到的，菌種保藏于江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室。尖孢鐮刀菌西瓜?；途?Fusariumoxysporumf.sp.Niveum，F(xiàn)ON)分離自1株患枯萎病的西瓜苗，此患病西瓜苗采自中國農業(yè)科學院祁陽紅壤試驗站連作西瓜實驗田。
1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g(液體培養(yǎng)基無需添加)。B6和FON菌株使用馬鈴薯固體或液體培養(yǎng)基(PDB)28 ℃培養(yǎng)3 d進行活化，備用。
1.2 方法
1.2.1 B6和FON的拮抗培養(yǎng)[18]使用打孔器分別打取直徑5 mm的B6和FON菌塊，再接種到新的PDA平板上，B6和FON間距為3 cm，平板正置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。
1.2.2 顯微鏡下觀察B6和FON菌絲之間的相互作用 按照1.2.1方式打取菌塊，同時在距離FON 1 cm處鋪一張無菌玻璃紙條(1 cm×5 cm)，28 ℃培養(yǎng)，當兩菌菌絲均長到玻璃紙上且發(fā)生相互接觸時，揭下玻璃紙，顯微鏡下觀察[19]。選取未放玻璃紙條的平板，培養(yǎng)15 d后，在兩菌交界處打取5 mm菌塊，組織勻漿器將其破碎，加無菌水混勻澄清后取1 mL上清液平板涂布后倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌絲的生長狀況。
1.2.3 B6無菌發(fā)酵液對FON生長和產孢的影響 選取PDB中培養(yǎng)15 d的菌株B6于5 000 r/min離心10 min獲得上清液，上清液用3層濾紙抽濾，0.22 μm濾膜過濾除菌。分別取2、5、10 mL發(fā)酵原液加入8、5、0 mL無菌水，得到稀釋倍數(shù)分別為5倍、2倍和原液的10 mL發(fā)酵液，再添加90 mL PDB與其混合均勻，然后倒平板冷卻凝固后接入5 mm FON菌塊，28 ℃培養(yǎng)7 d。先測量菌落直徑，再于培養(yǎng)皿中加入3 mL無菌水，用涂棒均勻涂布得孢子懸液，血球計數(shù)板測孢子數(shù)量。以10 mL無菌水添加90 mL PDB的平板作為對照，每個處理3個重復。
生長抑制率(%)=((對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑)×100
產孢抑制率(%)=((對照組產孢量-處理組產孢量)/對照組產孢量)×100
1.2.4 B6揮發(fā)性物質對FON生長、產孢及其菌絲形態(tài)的影響 打取1個FON菌塊和3個B6菌塊，分別接種到2個PDA平板上，一種是直接將2個平板的皿底相扣[20]，另一種是在距離FON菌塊1 cm處鋪一張無菌玻璃紙條(1 cm×5 cm)[19]。兩者用封口膜封好后保持FON的皿底向上于28 ℃培養(yǎng)7 d。前者測量FON菌落直徑，然后在接種FON的培養(yǎng)皿中加入3 mL無菌水，均勻涂布，得孢子懸液，血球計數(shù)板測量孢子數(shù)量。后者取出玻璃紙條用于顯微鏡觀察FON菌絲的變化。以未接B6菌塊的平板作為對照。
2 結果與分析
2.1 B6和FON的拮抗培養(yǎng)
圖1中a～b顯示，開始時兩種菌獨立生長，F(xiàn)ON菌落呈紫色，B6菌落呈淡黃色；c～d顯示B6生長較快，當培養(yǎng)到第3天時，兩菌菌絲接觸，接觸區(qū)域FON停止生長，B6在FON菌絲表面繼續(xù)生長，直到將FON完全覆蓋；e～h顯示，從平板底面觀察發(fā)現(xiàn)B6覆蓋區(qū)域FON紫色變成淡黃色，后又漸變成白色，當B6將FON完全覆蓋后，紫色完全消失。
圖1 B6和FON的對峙培養(yǎng)Fig.1 The dual culture of B6 and FONa～d：B6和FON培養(yǎng)3 d菌落正面；e～h：菌落反面a-d：the front colony maps of B6 and FON culture for 3 days；e-h：the negative colony maps
2.2 B6菌絲和FON菌絲之間的相互作用
圖2b中，可以發(fā)現(xiàn)B6菌絲在向外生長的過程中不斷分支，且分支與其生長主方向幾乎是垂直的，分支與附近的菌絲相接，為其他菌絲的生長提供支架作用，如此繼續(xù)形成復雜的網絡結構。c和d中，箭頭指示B6菌絲的分支形成附著胞似的結構附著到FON菌絲上繼續(xù)向外生長，可見其具有很強的競爭能力。e是B6菌絲頂端部位的放大，可以看到其頂端周圍有黑色物質，推測B6可能是通過這種物質識別周圍可供其附著的固定點，從而決定其分支生長的方向，利于其競爭生存空間。
將兩菌交界處打取的菌塊磨碎涂平板，培養(yǎng)3 d后平板上同時長出白色和紫色菌絲，即B6和FON的菌絲，這說明B6將FON完全覆蓋后并不會引起其菌絲死亡，只是通過競爭生存空間和營養(yǎng)物質而限制其生長。
2.3 B6無菌發(fā)酵液對FON生長和產孢的影響
與對照相比，培養(yǎng)基中加入B6無菌發(fā)酵液并沒有抑制FON的生長和產孢，反而在一定程度上對其生長和產孢有促進作用(表1)。
圖2 對峙培養(yǎng)中B6菌絲和FON菌絲之間的相互作用Fig.2 The interaction of B6 and FON in the dual culturea：FON菌絲；b：B6菌絲；c～d：B6菌絲的分支附著到FON菌絲；e：B6菌絲頂端部位a：FON；b：B6；c-d：B6 attached FON；e：the top part of B6
表1 B6無菌發(fā)酵液對FON菌落生長和產孢量的影響Table 1 The effect of sterile fermentation broth of B6 on the grow and sporulation of FON
2.4 B6揮發(fā)性物質對FON生長和產孢的影響
與單獨培養(yǎng)FON相比，對峙培養(yǎng)中B6產生的揮發(fā)性物質可以不同程度地抑制FON的生長和產孢，抑制率分別為20.9%和30.9%(表2)。
表2 B6揮發(fā)性物質對FON菌落生長和產孢量的影響Table 2 The effect of volatile substance of B6 on the grow and sporulation of FON
圖3 B6揮發(fā)性物質對FON菌絲形態(tài)的影響Fig.3 The effect of volatile substance of B6 on mycelial morphology of FON
與單獨培養(yǎng)的FON菌絲形態(tài)相比，B6和FON對峙培養(yǎng)時，F(xiàn)ON菌絲分枝變少(圖3)。B6產生的揮發(fā)性物質可能正是通過抑制FON的菌絲分支形成和降低FON菌絲生長速率來抑制FON的生長和產孢，這與前面的結果是一致的。
3 討 論
競爭、抗生和重寄生是內生真菌與病原菌之間的主要作用方式[21]。對峙培養(yǎng)試驗表明，B6具有很強的競爭能力，能夠在對峙培養(yǎng)中占據(jù)培養(yǎng)皿的大部分空間，最終完全覆蓋FON。紀明山等[22]在綠色木霉和尖孢鐮刀菌的對峙培養(yǎng)試驗中也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，綠色木霉菌絲能夠緊貼尖孢鐮刀菌菌絲平行生長或穿入菌絲生長，從而競爭尖孢鐮刀菌的生存空間使其菌絲解體。另外，Audrey等[23]研究了內生真菌Paraconiothyriumvariabile與Fusariumoxysporum的對峙培養(yǎng)，PV也會造成FO細胞的解體死亡。在顯微鏡下觀察B6和FON的菌絲相互作用，發(fā)現(xiàn)FON菌絲的外圍附著B6菌絲，可能是B6通過分泌某些物質識別FON菌絲來實現(xiàn)的，然而B6菌絲不會造成FON菌絲的斷裂和解體。進一步的實驗結果也證明雖然B6可以將FON完全覆蓋，但并不能導致其完全死亡。這些實驗結果表明，內生真菌B6和FON的相互作用機制僅僅是競爭，而不存在重寄生作用。
植物內生真菌與病原菌可在宿主體內進行相互競爭，主要是空間和營養(yǎng)[24-25]，前者能夠釋放各種具有抑菌活性的成分來抵御病原菌。通過對B6次級代謝產物的抑菌活性進行研究，發(fā)現(xiàn)B6發(fā)酵液并不能抑制FON的生長和產孢，而B6揮發(fā)性物質表現(xiàn)出抑菌活性，結果顯示其對FON生長抑制率為20.9%，產孢抑制率為30.9%。這表明B6與FON拮抗作用是揮發(fā)性代謝產物所致。例如，Angela等[26]發(fā)現(xiàn)菠蘿的1株內生真菌(Muscodorcrispans)能夠產生混合的揮發(fā)性物質，這些物質對許多植物和動物病原菌表現(xiàn)出廣譜殺菌性[27-28]，主要包括酯類、醇類和酸類。推測B6的揮發(fā)性物質不是單一存在的，有可能是幾種物質的混合，混合物的種類和結構成分的確定還需進一步探究。
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華南農業(yè)大學學報(2015年5期)2015-12-04 03:04:38
