姚 健,畢文慧,桂 倫,馬吉平 ,沈愛喜

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330200；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所，江西 南昌 330200;3.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟南 250100))

我國是一個農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，每年都會產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物和下腳料，如稻殼、秸稈、麥麩和玉米芯等。由于缺乏有效合理的處理方式，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中仍采用焚燒的方法處理這些農(nóng)業(yè)廢棄物，不僅浪費資源，還造成環(huán)境污染、病蟲害傳播。在能源短缺、環(huán)境污染嚴(yán)重的環(huán)境下，如何有效利用這部分生物資源成為急需解決的一大問題。半纖維素作為植物細胞壁的主要成分，是由幾種不同類型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體(包括木糖、阿拉伯糖和半乳糖等)，其含量僅次于纖維素，約占植物干重的35%，主要組成部分為木聚糖。木聚糖是一種由β-1，4-糖苷鍵連接而成的木糖聚合物，完全降解需要多種酶的共同參與，包括β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙?；揪厶敲负头铀狨ッ浮Ｆ渲笑?1，4-內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是木聚糖降解過程中的關(guān)鍵酶。木聚糖酶降解木聚糖產(chǎn)生的低聚木糖在飼料工業(yè)及畜牧業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價值，可提高飼料的利用率，促進動物腸道內(nèi)雙歧桿菌的定殖，增強免疫力，增進動物健康，還能改善動物腸道微生物的生態(tài)平衡，減少糞便中腐敗物物質(zhì)的產(chǎn)生，降低環(huán)境污染[1-3]。目前，低聚木糖主要來源于木聚糖的降解，若能有效利用木聚糖酶降解玉米芯等農(nóng)林廢料生產(chǎn)低聚木糖，將對資源利用、環(huán)境保護以及經(jīng)濟效益的提高具有重大意義。另外，木聚糖酶在食品[4]、造紙[6-9]、紡織等行業(yè)也都起到了重要作用。木聚糖酶在自然界中分布廣泛，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)從細菌[10-14]、真菌[15-19]、植物以及無脊椎動物中分離到了木聚糖酶。目前，有關(guān)木聚糖酶生產(chǎn)的研究集中于單一菌株，而以復(fù)合菌株生產(chǎn)木聚糖酶的研究較少。利用單一菌的木聚糖酶發(fā)酵液處理玉米芯生產(chǎn)低聚木糖時，需預(yù)先經(jīng)堿處理玉米芯提取木聚糖，而本研究篩選到的木聚糖酶降解菌群利用玉米芯生產(chǎn)低聚木糖時，不需預(yù)先堿處理可以直接降解玉米芯粉生產(chǎn)低聚木糖(主要以木三糖和木四糖為主)，對減輕低聚木糖工業(yè)化生產(chǎn)過程中設(shè)備生產(chǎn)壓力以及環(huán)境污染都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 獲取微生物菌群的樣品來源于堆置發(fā)酵時間為3 d，發(fā)酵溫度為40 ℃的豬糞與甘蔗葉混合堆肥(初始C/N比為25∶1，含水率為60%，初始pH為8.0)20 g。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①富集培養(yǎng)基I：稱取樣品20 g，加入200 mL ddH2O，加入玻璃珠10 g，100 r/min震蕩過夜，8 000 r/min離心10 min，取上清，過濾除菌作為富集培養(yǎng)基；②富集培養(yǎng)基II(g/L)：NaNO32.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，木聚糖 10，定容至1 L，115 ℃滅菌25 min；③產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：NaNO32.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，玉米芯4.0(60目過篩)，定容至1 L，121 ℃滅菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖降解微生物菌群的制備 稱取堆肥樣品5 g，接種至100 mL富集培養(yǎng)基I中，30 ℃，160 r/min震蕩培養(yǎng)3 d；取5 mL培養(yǎng)液接種至富集培養(yǎng)基II中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d；再從中取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮富集培養(yǎng)基II中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d，如此反復(fù)培養(yǎng)6次，獲得含木聚糖降解微生物菌群的培養(yǎng)液。同時取10 mL培養(yǎng)液測木聚糖酶活性。

1.2.2 微生物菌群的結(jié)構(gòu)鑒定 利用細菌提取試劑盒提取基因組，16S rRNA-v4區(qū)基因PCR擴增：50 μL體系，25 μL PrimerSTAR Max DNA 聚合酶(2×)，1 μL模板，引物F (5′-AAATTTTTTTTCCCCCCCGG-3′)和R (3′-GGGCCCCCTTTAAAAA-AAAAC-5′)各1 μL，22 μL ddH2O；反應(yīng)程序：98 ℃ 4 min，98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物送華大基因測序。

1.2.3 木聚糖酶酶活性測定 木聚糖酶酶活性檢測采用Megazyme試劑盒說明書進行，具體方法如下：取200 μL發(fā)酵液，加入100 μL 1% AZO-xylan (Birchwood)，55 ℃水浴2 min，8 000 r/min離心5 min，加入500 μL 95%的乙醇，混勻后室溫放置5 min，取上清于590 nm測定光吸收值。以100 ℃處理10 min的粗酶液作為陰性對照，每個樣品設(shè)置3個平行。本研究中木聚糖酶酶活性測定均采用該方法。將1個酶活單位定義為從阿拉伯木聚糖中釋放1 μmol D-木糖所用的酶量。

1.2.4 菌群生產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化 取1.2.1制備的新鮮培養(yǎng)液1 mL，接種至20 mL無菌富集培養(yǎng)基II中，40 ℃，160 r/min培養(yǎng)過夜，作為制備木聚糖酶發(fā)酵液的種子液。①不同玉米芯濃度的優(yōu)化：取玉米芯濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%和0.8%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至9.0，40 ℃、160 r/min 震蕩培養(yǎng)4 d，測木聚糖酶活性；②不同培養(yǎng)溫度優(yōu)化：選取25、30、35、40和45 ℃分別作為菌體的培養(yǎng)溫度，160 r/min 震蕩培養(yǎng)4 d，測木聚糖酶活性；③不同初始pH的優(yōu)化：選取pH 6.0、7.0、8.0、9.0和10.0分別作為菌體培養(yǎng)的初始pH，40 ℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)4 d，測木聚糖酶活性；④不同培養(yǎng)時間的優(yōu)化：在最佳溫度、初始pH和玉米芯濃度的基礎(chǔ)上，在菌體培養(yǎng)的過程中每隔24 h取樣，共取樣3次，測木聚糖酶活性。

1.2.5 菌群發(fā)酵液中木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析 ①最適反應(yīng)溫度：在反應(yīng)溫度為20～70 ℃的條件下測定其酶活性，得到其最適反應(yīng)溫度(以酶活力最高時記為100%)；②最適反應(yīng)pH：調(diào)整發(fā)酵液pH值分別為pH 6.0～8.0 (100 mmol/L磷酸鹽緩沖液)、pH 7.5～9.0 (100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液)、pH 8.5～10.0 (100 mmol/L glycine-NaOH 緩沖液)，在最適反應(yīng)溫度下測定粗酶液的木聚糖酶活性(以酶活力最高時記為100%)；③溫度穩(wěn)定性：將發(fā)酵液分別在30、35、40、45、50、55、60、65和75 ℃條件下保溫2 h，在最適反應(yīng)溫度及pH條件下測定剩余酶活性，得到酶的熱穩(wěn)定性，以4 ℃條件下保存酶液的酶活性定義為100%；④pH穩(wěn)定性：將發(fā)酵液分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的條件下保溫0.5 h，在最適反應(yīng)溫度及pH條件下測定剩余酶活性，得到酶的pH穩(wěn)定性，以4 ℃條件下保存酶液的酶活性定義為100%；⑤SDS-PAGE電泳及酶譜分析：SDS-PAGE電泳按照Laemmli[20]的方法進行，分離膠濃度12%，濃縮膠5%，電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍G250染色10 min，脫色。酶譜分析在分離膠中添加0.1%的玉米芯木聚糖，采用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE電泳，用25%的異丙醇溶液使蛋白復(fù)性，50 ℃條件下保溫1 h，然后染色[21]；⑥微生物菌群發(fā)酵液水解玉米芯制備低聚木糖：取0.01 g粉碎的玉米芯粉，加入3 mL發(fā)酵液，55 ℃反應(yīng)4 h，12 000 r/min離心10 min,取上清，采用薄層層析法檢測上清液中的糖成分。展開劑：V正丁醇∶V乙酸∶V水=2∶1∶1，顯色劑：V甲醇∶V濃硫酸=95∶5，烘烤顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶生產(chǎn)菌群的群落結(jié)構(gòu)分析

對富集到的菌群進行16S rRNA-v4區(qū)分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，該菌群中未知無法分類的菌屬約50.8%；已知可分類的菌屬約占49.2%，主要由無色桿菌屬、蒼白桿菌屬、原小單胞菌屬、貪銅菌屬、寡養(yǎng)食單胞菌屬、金黃桿菌屬、草螺菌屬、細小桿菌屬等組成，其中草螺菌屬占24.9%、寡養(yǎng)食單胞菌屬占11.1%，金黃桿菌屬占5.6%。

2.2 菌群發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的條件優(yōu)化

溫度、pH、碳源濃度及培養(yǎng)時間等發(fā)酵條件對菌種的生長、繁殖、代謝有著重要的影響，因此設(shè)置適宜的培養(yǎng)條件對微生物產(chǎn)酶量的提升起著關(guān)鍵作用。對碳源濃度、初始培養(yǎng)pH、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間研究發(fā)現(xiàn)，玉米芯濃度為0.2%時，發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性最高；玉米芯濃度為0.8%時，發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性較低，為最高酶活性的96.3%，總體來說，玉米芯濃度在0.2%～0.8%范圍內(nèi)，對發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的酶活性影響不大(圖2A)。初始培養(yǎng)pH為9.0時，發(fā)酵液中木聚糖酶活性最高，初始pH在7.0～10.0之間時，培養(yǎng)pH對發(fā)酵液中木聚糖酶活性影響不大，酶活性均高于90%，隨著pH的升高，酶活性迅速降低，為最高酶活性的50%左右(圖2B)。此外，培養(yǎng)溫度及時間對發(fā)酵液中木聚糖酶活性的影響研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度和時間分別在40 ℃和5 d時，發(fā)酵液中木聚糖酶的活性最高，其后隨著溫度的升高及培養(yǎng)時間的延長，其酶活性均迅速降低(圖2C和2D)。

圖1 富集樣品在屬分類水平上中的分析柱狀圖Fig.1 The profiling histogram of enriched samples at the genus classification level

2.3 菌群發(fā)酵液中木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 發(fā)酵液中木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度 在反應(yīng)溫度為20～70 ℃的條件下測定發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性，得到其最適反應(yīng)溫度(以酶活力最高時記為100%)。如圖3所示，在限定溫度下，當(dāng)溫度低于55 ℃時，發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性隨著溫度的升高而升高；隨著溫度的升高，木聚糖酶活性逐漸降低；在最高反應(yīng)溫度70 ℃下，其酶活性為最高酶活性的87%左右。

圖2 菌群發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of conditions for producing xylanase by bacteria consortium

圖3 發(fā)酵液中木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度Fig.3 Effect of temperature on the activity of xylanase

2.3.2 發(fā)酵液中木聚糖酶的最適反應(yīng)pH 在反應(yīng)溫度55 ℃，pH為 6.0～10.0的條件下測定發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性，得到其最適反應(yīng)pH(以酶活力最高時記為100%)。如圖4所示，當(dāng)pH低于8.0時，發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性隨pH值的升高逐漸升高；由于在pH 8.5～10.0條件下測得的發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性均低于pH 8.0時的酶活性，因此在以AZO-xylan作為底物時，將pH 8.0定義為發(fā)酵液中木聚糖酶的最適反應(yīng)pH。

圖4 發(fā)酵液中木聚糖酶的最適反應(yīng)pHFig.4 Effect of pH on the activity of xylanase

2.3.3 發(fā)酵液中木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性 將發(fā)酵液分別在30、35、40、45、50、55、60、65和75 ℃條件下保溫2 h，然后在55 ℃和pH 8.0條件下測發(fā)酵液中木聚糖酶的剩余酶活性(以4 ℃條件下保存酶液的酶活性定義為100%)。如圖5所示，發(fā)酵液中的木聚糖酶在溫度低于55 ℃條件下處理2 h，保持較高的溫度穩(wěn)定性，其酶活性沒有明顯的改變，其后隨著溫度的升高，其溫度穩(wěn)定性明顯降低，60 ℃處理2 h后，剩余酶活性僅為原來的30%左右。

圖5 發(fā)酵液中木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性Fig.5 Effect of temperature on the stability of xylanase

2.3.4 發(fā)酵液中木聚糖酶的pH穩(wěn)定性 將發(fā)酵液分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0條件下保溫0.5 h，然后在55 ℃和pH 8.0條件下測發(fā)酵液中木聚糖酶的剩余酶活性(以4 ℃條件下保存酶液的酶活性定義為100%)。如圖6所示，發(fā)酵液中木聚糖酶在pH 5.0～9.0之間處理0.5 h，能保持很好的pH穩(wěn)定性，其酶活性沒有明顯的變化，其后隨著pH的升高，其酶活性逐漸降低，但在pH 10.0時，仍保有較高的酶活性，為最高酶活性的95%左右。

圖6 發(fā)酵液中木聚糖酶的pH穩(wěn)定性Fig.6 Effect of pH on the stability of xylanase

2.3.5 SDS-PAGE電泳及酶譜分析 發(fā)酵液的SDS-PAGE及木聚糖酶酶譜結(jié)果如圖7所示，該菌群可分泌的3種木聚糖酶，其分子質(zhì)量大小分別約為200、45和40 kDa。

2.3.6 菌群發(fā)酵液中木聚糖酶降解玉米芯的產(chǎn)物分析 經(jīng)木聚糖酶發(fā)酵液處理后的玉米芯粉，通過薄層層析分析發(fā)現(xiàn)，玉米芯粉可以被菌群發(fā)酵液中的木聚糖酶直接降解為低聚木糖(主要成分為木三糖和木四糖)(圖8)，而不需經(jīng)過堿預(yù)處理提取木聚糖。

圖7 SDS-PAGE及酶譜分析Fig.7 SDS-PAGE and zymogram analysisM1：低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；M2：高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：木聚糖酶酶譜；2：活性蛋白電泳；3：非活性蛋白電泳M1：Protein marker (low)；M2：Protein marker(high)；1：Spectrum of xylanase enzyme；2：SDS-PAGE electrophoresis of active proteins；3：SDS-PAGE electrophoresis of denaturedproteins

圖8 發(fā)酵液處理玉米芯粉薄層層析Fig.8 TLC analysis of corn kernel meal hydrolyzed by xylanaseM：木糖標(biāo)準(zhǔn)品；1：發(fā)酵液處理玉米芯4 h；2：發(fā)酵液處理玉米芯0 hM：xylooligosaccharide standards；1：The corn cob powder treated with fermentation liquor for 4 h；2：The corn cob powder treated with fermentation liquor for 0 h

3 討 論

迄今為止，人們已經(jīng)從環(huán)境中篩選到了許多產(chǎn)木聚糖酶的菌株。如張曉元等[22]從山東某造紙廠排水溝旁堿性土壤中篩選到1株產(chǎn)木聚糖酶的芽胞桿菌BacillussubtilisZH-07，可以利用從玉米芯中提取的木聚糖為惟一碳源產(chǎn)酶；王中月等[23]從土壤中篩選到1株細菌Paenibacillussp.39631，不僅可以利用從玉米芯中提取的木聚糖做為碳源，也可以直接利用玉米芯粉作為碳源產(chǎn)木聚糖酶。本研究通過分步富集培養(yǎng)的方法從豬糞與甘蔗葉混合堆肥中得到一組木聚糖酶生產(chǎn)菌群，該菌群中已知的微生物主要以草螺菌屬、寡養(yǎng)食單胞菌屬和金黃桿菌屬為主；該菌群可以直接利用玉米芯粉作為碳源發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶，所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)pH為8.0，與來源于Cladosporiumoxysporum的木聚糖酶相似[24]；最適反應(yīng)溫度為55 ℃，高于AspergillusfumigatusR1所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度[25]。在低于55 ℃時，菌群發(fā)酵液中木聚糖酶保持較高的溫度穩(wěn)定性，處理2 h，其酶活性沒有明顯的變化，其穩(wěn)定性明顯高于來源于芽胞桿菌B695[26]。此外，發(fā)酵液中的木聚糖酶也保持較高的pH穩(wěn)定性，pH 5.0～9.0之間處理0.5 h，能保持很好的pH穩(wěn)定性，其酶活性沒有明顯的變化。李琦等[27]研究發(fā)現(xiàn)來源于嗜熱網(wǎng)球菌的木聚糖酶可以水解堿法提取的玉米芯木聚糖制備低聚木糖，而本研究發(fā)現(xiàn)的菌群發(fā)酵液可以直接水解玉米芯粉制備低聚木糖(木三糖和木四糖為主)，省去了堿處理玉米芯制備木聚糖的步驟，從而降低了環(huán)境污染以及生產(chǎn)成本。