粟莎莎， 張姝， 黃健， 陳曦， 李艷， 方立超， 鄧鈞， 莫非**， 鄭峻松**

(1.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 3.陸軍軍醫(yī)大學 藥學與檢驗醫(yī)學系， 重慶 400038)

DNA甲基化一直是表觀遺傳領域研究的前沿和熱點，由于其在細胞分化、胚胎發(fā)育、遺傳性疾病和腫瘤發(fā)生等基因表達調控方面起著重要作用，DNA甲基化分析已成為表觀遺傳紊亂疾病和腫瘤早期預警的新手段[1-5]。傳統(tǒng)DNA甲基化檢測技術存在一定的不足，如重亞硫酸氫測序存在測序深度、轉化效率和龐大數(shù)據(jù)分析等不足，甲基化限制性酶切分析引物設計受酶識別序列的限制等,高效液相色譜、質譜等操作繁瑣且需要龐大的儀器設備[6-11]。電化學傳感分析檢測技術克服了以上缺點，具有成本低、操作簡便、響應快速、靈敏度高和設備易于小型化等諸多優(yōu)點[12-14]，國內外應用電化學傳感器檢測DNA甲基化主要是通過檢測DNA甲基轉移酶的活性間接反映DNA甲基化的水平，靈敏度、特異性仍有待提高[15]。本研究利用甲基化CpG結合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2)特異性識別結合DNA甲基化位點，以葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)雙酶標記的抗體作為信號放大體系，通過級聯(lián)催化作用實現(xiàn)信號放大，同時利用電極表面修飾的納米金有效促進電極表面的電子轉移，兩者相結合，探討DNA甲基化的定量檢測效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

CHI660D電化學工作站購自上海辰華儀器公司，電極為三電極體系，輔助電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極為金電極(直徑為2 mm)。crossbeam 340 zeiss掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope, SEM)購自德國蔡司公司，氯金酸(HAuCl4)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)及人重組MeCP2購自上海近岸科技有限公司，GOD、HRP和抗6×His鼠單克隆抗體(Anti-His tag antibody)購自上海生物工程有限公司，K3[Fe(CN)6]、K4Fe(CN)6·3H2O、NaCl和MgCl2購自國藥集團化學試劑有限公司，三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(Tris-EDTA, TE)緩沖液、KCl、磷酸鹽(phosphate buffer saline, PBS)緩沖粉劑和三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽[Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride, TCEP]購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，其他所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水(電阻率18.2 MΩcm)。

1.2 DNA序列

探針序列5′-HS-(CH2)6-GCG CGC TGG GTG GGCm CCC GCG GCG CT-3′，甲基化序列5′-AC GCC GCG GGG CmCC ACC CAG CGC GC-3′，非甲基化序列5′-AGC GCC GCG GCG CCC ACC CAG CGC GC-3′。

1.3 方法

1.3.1緩沖液的配制 緩沖液有3種：一是探針固定緩沖液(50 mmol/L NaCl、1.0 mmol/L TCEP和pH 7.4的1×TE緩沖液)，即準確稱取NaCl 0.029 g、TCEP 0.002 8 g，用適量1×TE緩沖液溶解并定容至10 mL所得；二是雜交緩沖液(50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2和pH 7.4的1×TE緩沖液)，準確稱取NaCl 0.029 g、MgCl20.020 3 g，用適量1×TE緩沖液溶解并定容至10 mL所得；三是蛋白固定緩沖液，即量取5 mL甘油，倒入容量瓶后加入1×PBS定容至100 mL所得。

1.3.2雙酶標記抗體的制備 HRP和GOD標記抗體分兩個階段完成，第一階段是根據(jù)文獻[16]標記GOD，即1 g/L抗體逐滴加入溶有GOD 2 mg的1.25%戊二醛溶液中，加入1 mol/L、pH 9.5 PBS進行攪拌，繼續(xù)加入200 mmol/L賴氨酸混勻后，4 ℃靜置1 h，離心棄上清液，沉淀物即為GOD/anti-His tag；第二階段是根據(jù)文獻[17]將HRP偶聯(lián)到GOD/anti-His tag上，先用60 mmol/L的過碘酸鈉和160 mmol/L的乙二醇混合液將HRP活化，將酶與GOD標記后的抗His tag抗體按1 ∶1比例進行偶合。依次加入濃度為5 g/L的硼氫化鈉溶液和等體積的飽和硫酸銨溶液，再次離心、棄上清液，并用10 mmol/L PBS重懸，混合液在0.15 mol/L PBS中透析，透析結束后將標記的抗體與等體積甘油混合，標記產(chǎn)物記為GOD-HRP/anti-His tag，取適量進行紫外可見分光光譜掃描鑒定，其余分裝后于-20 ℃避光保存。

1.3.3DNA電化學生物傳感器構建 (1)AuNPs/Au的制備：首先用0.05 μm的Al2O3拋光粉將金電極(Au)在麂皮上打磨光滑，接著依次用丙酮、乙醇和超純水各超聲清洗5 min，清洗完成后將電極置于新鮮配制的Piranha溶液(98%硫酸溶液與30%過氧化氫按3 ∶1體積比混合)中活化15 min，完成活化過程；取出電極，用0.5 mol/L濃硫酸進行電化學清洗，直到獲得穩(wěn)定重復的循環(huán)伏安曲線，隨后用超純水將電極表面徹底淋洗干凈；在3 mmol/L氯金酸溶液(含0.1 mol/L硝酸鉀)中于-0.2 V電位下沉積120 s，再次充分淋洗電極，并用氮氣吹干，制備得納米金(AuNPs)修飾的電極，標記為AuNPs/Au，然后采用SEM對電沉積納米金的表面形貌進行表征，觀察納米粒的大小及分布情況，并推算出納米金的直徑大小。(2)探針固定與雜交：在上述制備的AuNPs/Au電極上滴加10 μL探針固定緩沖液(含0.1 μmol/L巰基化探針DNA)，4 ℃放置12 h，得到探針DNA修飾的電極，雜交之前先用PBS和超純水充分淋洗干凈以除去多余吸附的DNA探針，滴加10 μL雜交緩沖液(含0.1 μmol/L靶DNA)，于37 ℃雜交1 h，電極取出后再次用PBS和超純水淋洗干凈。(3)DNA電化學生物傳感器構建過程的電化學表征：電極每一步組裝后均在含0.1 mol/L KCl的3 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中采用電化學阻抗法(Electrochemical impedance spectroscopy, EIS)掃描，EIS參數(shù)設置為初始電位0.24 V，頻率范圍0.1～105 Hz，掃描速度50 mV/s。(4)MeCP2蛋白固定與免疫反應：雜交完成后，電極用0.5% BSA封閉30 min，接著滴加10 μL、200 mg/L MeCP2置于37 ℃水浴箱孵育1 h，PBS淋洗3次，滴加10 mg/L GOD-HRP/anti-His tag液10 μL 、 于37 ℃完成免疫反應，最后PBS淋洗3次待干。(5)電化學信號測定：將電極浸入含0.5 mmol/L 葡萄糖10 mL和0.25 mmol/L對苯二酚的PBS溶液中，采用差分脈沖伏安法(Differential pulse voltammetry, DPV)進行掃描并記錄峰電流大小，DPV檢測參數(shù)設置為電壓范圍-0.1～0.6 V，脈沖幅度0.05 s，脈沖寬度0.05 s，脈沖周期0.2 s，靜置時間2 s。

1.3.4可行性分析 按照1.3.3項下的方法制備DNA電化學生物傳感器對0.1 μmol/L非甲基化DNA與甲基化DNA進行測定，通過比較各自的峰電流大小，對該電化學檢測方法的可行性進行驗證。

1.3.5DNA甲基化定量分析 將0.1 μmol/L甲基化DNA按10倍比稀釋依次得到1.0×10-8、1.0×10-9、1.0×10-10、1.0×10-11、1.0×10-12、1.0×10-13、1.0×10-14、1.0×10-15及1.0×10-16mol/L的靶序列溶液，按照1.3.3項下的方法制備DNA電化學生物傳感器，用電化學方法測得該傳感器的最低檢測限，通過所得電信號對靶標濃度作線性關系曲線，計算回歸方程和相關系數(shù)r。

1.3.6雙酶信號放大策略的電化學表征 實驗設置3組實驗體系，分為GOD和HRP雙酶標記體系(GOD-HRP/anti-His tag)、單獨HRP標記體系(HRP/anti-His tag)及單獨GOD標記體系(GOD/anti-His tag)，在相同的條件下，將所制備的DNA電化學生物傳感器先后進行雜交、MeCP2蛋白固定后，再與3組不同的酶標記抗體反應，通過比較各自DPV峰電流的大小，考察實驗所設計的雙酶信號放大策略的放大效果。

1.3.7傳感器的重復性與穩(wěn)定性研究 在相同條件下，同時制備5支電化學免疫傳感器，對0.1 μmol/L甲基化DNA同時進行檢測，比較結果之間的差距，計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)，評價該電化學方法檢測甲基化DNA的重復性；通過將制備好的電極浸入0.1 mol/L、pH 7.4的PBS溶液中，于4 ℃冰箱放置，每7天測定1次，評估電化學生物傳感器的穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 雙酶修飾抗體表征

將偶聯(lián)物進行紫外掃描鑒定，HRP的最大吸收光譜分別為403 nm，GOD的最大吸收光譜為275 nm，雙酶標記抗體后的最大吸收峰向HRP及GOD的最大吸收峰處偏移。見圖1。

圖1 HRP、GOD和GOD-HRP/anti-His tag antibody的紫外-可見光譜分析Fig.1 UV-visible spectroscopy of HRP, GOD and GOD-HRP/anti His tag antibody

2.2 AuNPs/Au形貌表征

采用SEM表征納米金修飾的金電極AuNPs/ Au形貌，AuNPs呈球形、均勻地分布在電極表面，其直徑大小約為35 nm。見圖2。

圖2 納米金修飾金電極SEMFig.2 SEM image of electrode covered with AuNPs

2.3 傳感器構建的電化學表征

用電化學阻抗法研究傳感器制備過程中的電化學特性，裸電極的電阻抗圖可以觀察到有一個很小的半圓，表明電極表面電阻很小；當修飾上納米金后，幾乎變?yōu)橐粭l直線，電阻減?。划斕结樈M裝在電極表面后，其負電荷的磷酸骨架排斥[Fe(CN)6]3-/4-，曲線半圓增大，電阻增大；同樣，當電極表面的探針DNA與互補序列雜交形成DNA雙鏈，電極表面的負電荷增多，電阻繼續(xù)增大；當MeCP2蛋白結合在甲基化的CpG上后，蛋白的分子結構對電極表面的電子轉移有一定的阻礙，電阻進一步增大。見圖3。

注：1為納米金修飾金電極，2為裸Au，3為探針固定，4為雜交，5為MeCP2蛋白固定。圖3 DNA電化學生物傳感器構建的電化學表征Fig.3 Characterization of EIS of the self-assembling electrochemical biosensor

2.4 可行性分析

非甲基化DNA出現(xiàn)較小的背景電流，約2.6 μA；甲基化DNA則出現(xiàn)顯著的氧化電流信號，約9.1 μA，是非甲基化DNA電信號的3.5倍。見圖4。

2.5 DNA甲基化定量分析

在優(yōu)化的實驗條件下，隨著甲基化靶序列DNA濃度的增加，DPV峰電流逐漸增加；在10-14～10-7mol/L范圍內，DPV峰電流的大小與甲基化的靶DNA濃度對數(shù)呈線性關系，線性回歸方程為I(峰電流值，μA)=1.038lgC(DNA甲基化的濃度，mol/L)+16.598，相關系數(shù)r為0.993，檢測限為0.1 fmol/L。見圖5。

圖4 0.1 μmol/L甲基化DNA與0.1 μmol/L非甲基化DNA的DPV電信號檢測Fig.4 DPV signals in response to 0.1 μmol/L unmethylated DNA and methylated DNA

2.6 雙酶信號放大的表征

雙酶標記體系的DPV峰電流最高，達9.105 μA，單獨HRP標記體系的DPV峰電流約為1.99 μA，單獨GOD標記體系的電信號極其微弱，僅為0.969 μA。見圖6。

2.7 電化學免疫傳感器的重復性與穩(wěn)定性

通過同時制備5支電化學免疫傳感器，在相同條件下對0.1 μmol/L濃度的靶甲基化DNA進行電化學檢測，RSD為4.6%；將傳感器置于pH 7.4的PBS中，響應電流非常穩(wěn)定，28 d后其電流大小為最初電流的93.7%，提示所制得的傳感器具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

注：A為電流響應曲線，B為回歸曲線。圖5 電化學生物傳感器對不同濃度甲基化DNA的電流響應曲線及其回歸曲線Fig.5 The DPV curves at different concentrations of methylated DNA and the correlation of peak current and DNA methylation concentration

圖6 雙酶標記體系的電化學表征Fig.6 The effect of different enzyme-labeled antibodies on DPV response currents

3 討論

到目前為止，DNA甲基化的檢測方法已經(jīng)開發(fā)出很多種，每種方法都有各自的優(yōu)勢與劣勢，對DNA甲基化檢測技術特異性、靈敏度以及高效性要求更高，生物傳感分析無疑成為DNA甲基化檢測新方法研究的趨勢，其在DNA甲基化的檢測方面顯示出了研究人員期待的優(yōu)點：快速、相對廉價、靈敏度高、能進行多樣本分析、易于小型化、特別適合床旁檢測。因此，生物傳感技術也成為當前DNA甲基化研究領域的熱點。本研究提出了一種簡單而靈敏的DNA電化學免疫傳感檢測方法，首先，采用納米金修飾金電極，其作用有三：一是提高電極比表面積，增大探針固載量；二是納米金和探針之間通過Au-S鍵結合，使得探針牢牢固定在電極表面；三是促進電子轉移[18-21]。因此，納米金在本研究中具有重要的作用。掃描電鏡觀察到采用電沉積制備的納米金呈球形，均勻地分布在電極表面，表明電極的比表面積擴大；EIS表征納米金修飾電極后電阻較裸金電極減小，可明顯提高檢測的靈敏度，具有信號放大作用。傳感器構建過程的EIS表征證明各成分均成功組裝在電極上，傳感器構建成功。其次，本研究利用MeCP2特異性結合雙鏈DNA甲基化位點能力，有效保證檢測結果的可靠性，這一結論通過對傳感器的可行性分析得以證實。第三，在本次設計的3種標記體系中，采用GOD和HRP聯(lián)合標記的雙酶體系比單獨標記HRP的體系提高約4.6倍。通常的電化學免疫傳感器都是單獨采用某種酶進行標記，與之不同的是，雙酶聯(lián)合催化信號放大的機制在于GOD和HRP的聯(lián)合催化作用，即GOD催化葡萄糖氧化在電極表面原位產(chǎn)生H2O2，后者會立即被HRP利用，將對苯二酚氧化生成苯醌，從而檢測電子轉移，加上電極表面修飾的AuNPs有效促進了電子轉移，從而實現(xiàn)雙重信號放大，通過該方法最終獲得甲基化DNA濃度低至0.1 fmol/L的檢測限，線性范圍為10-14～10-7mol/L，重復性實驗RSD為4.6%，比以往研究結果低[21-23]，具有較好的重復性。但傳統(tǒng)方法如比色法、高效液相色譜、重亞硫酸氫鹽轉化、毛細管電泳法等，這些方法大多存在樣本用量大、檢測時間長、處理復雜等缺點，相比而言，本實驗設計的電化學免疫傳感器是一種相對簡單、快速、靈敏的檢測方法，更適用于臨床分析。

綜上所述，本研究采用雙酶標記信號放大技術制備的電化學免疫傳感器具有超高的靈敏度，能實現(xiàn)痕量DNA甲基化的檢測，有望成為腫瘤和其他甲基化相關疾病早期診斷有用的分析工具。