劉務(wù)玲， 姚堯， 陳娟， 吳昌學(xué)， 宋晶睿， 王春林， 邱劍飛，王立平， 朱偉明,3， 龍群**， 李艷梅**

(1.貴州省中國科學(xué)院 天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550014; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550025; 3.中國海洋大學(xué)， 山東 青島 266100)

白血病，又稱血癌，是未成熟的血細(xì)胞異常過度增殖而導(dǎo)致的一種血液癌癥，主要有急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病及慢性髓系白血病[1-2]。AML是白血病的一種，其特征是異常細(xì)胞在骨髓和血液中快速增殖，干擾正常血細(xì)胞功能。AML進(jìn)展較為迅速，如果沒有獲得有效治療，患者通常會在數(shù)周至數(shù)月內(nèi)死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì),2015年全球約有白血病患者230萬人，其中約100萬人患有AML，美國癌癥協(xié)會根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)預(yù)測2018年在美國AML將是死亡案例最多的白血病。目前，臨床上主要采用化療方案治療AML[4]，米哚妥林(midostaurin，PKC-412)是目前美國FDA唯一批準(zhǔn)用于靶向麥克唐納貓肉瘤(feline mcdonough sarcoma, FMS)樣的酪氨酸激酶3 (Fms-like tyrosine kinase, FLT3)治療AML的藥物[5]，該藥物在臨床使用后會部分出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致治療效果不佳[6]。因此，開發(fā)更多治療AML的新藥尤為重要。HEL細(xì)胞是AML中紅白血病的一種細(xì)胞系，可作為AML相關(guān)研究的典型細(xì)胞[7-10]，本研究選擇HEL細(xì)胞作為研究對象，研究雙吲哚馬來酰亞胺衍生物化合物GZWM-051對HEL細(xì)胞的作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人HEL細(xì)胞、人慢性髓系白血病K562細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室留存，雙吲哚馬來酰亞胺衍生物GZWM-051由中國海洋大學(xué)朱偉明教授課題組設(shè)計(jì)合成，純度>95%。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；Hoechst 33258、MTT試劑及二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白裂解液及BCA蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；Bcl-2、Casepase-3、Caspase-3剪切體(cleaved casepase-3)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)一抗購自美國Abcam公司，熒光標(biāo)記抗兔二抗購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞增殖活性采用MTT法，取對數(shù)期增長的HEL、K562細(xì)胞以8×103個/孔接種于一次性滅菌96孔板，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，分別使用0.05、0.10及0.20 μmol/L GZWM-051，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照(等量DMSO)和陽性對照(0.2 μmol/L PKC-412)。在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48及72 h，分別加入5 000 mg/L的MTT試劑，然后37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，2 000 r/min離心20 min收集細(xì)胞，加入DMSO后置于搖床180 r/min動態(tài)處理20 min，490 nm波長下測定吸光度值(OD490值)；計(jì)算GZWM-051對細(xì)胞系的IC50及抑制率，繪制生長曲線。

1.2.2HEL細(xì)胞凋亡采用流式細(xì)胞術(shù)，取對數(shù)生長期HEL細(xì)胞以2×106個/孔接種于6孔板，使用0.025、0.050及0.100 μmol/L GZWM-051分別處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組(等量DMSO)；置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24及48 h，收集細(xì)胞，用1×PBS洗滌細(xì)胞， 2 000 r/min 離心5 min收集細(xì)胞；將細(xì)胞凋亡試劑用10×binding buffer稀釋10倍，于細(xì)胞沉淀中加入稀釋后的細(xì)胞凋亡試劑100 μL，徹底重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管；加入PI染液及Annexin V-FITC染液各5 μL，輕輕混勻，避光37 ℃處理15 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3HEL細(xì)胞凋亡采用Hoechst 33258染色，取對數(shù)生長期HEL細(xì)胞以1×105個/孔接種于6孔板，以0.025、0.050 及0.100 μmol/L GZWM-051分別處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組(等量DMSO)。細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用1×PBS洗滌細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用甲醇固定細(xì)胞10 min，再用1×PBS洗滌細(xì)胞，用Hoechst 33258處理細(xì)胞，室溫避光染色10 min。去除染色液后用1×PBS洗滌2次，置于熒光顯微鏡上檢測并分析。

1.2.4腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白采用Western blot法，取對數(shù)生長期HEL細(xì)胞以4×105/孔接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使用0.025、0.050及0.100 μmol/L GZWM-051分別處理細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組(等量DMSO)。培養(yǎng)24 h時(shí)，收集細(xì)胞，用預(yù)冷1×PBS洗滌細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入含PMSF的蛋白裂解液，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。每隔5 min渦旋1次，冰上裂解30 min后置預(yù)冷離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min。取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品濃度，用蛋白裂解液調(diào)平濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱煮沸5 min變性蛋白，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肧DS-PAGE凝膠分離蛋白樣品后轉(zhuǎn)移至0.2 μm的PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉后用抗體4 ℃孵育過夜，1×TBS洗膜，用熒光標(biāo)記抗兔二抗室溫孵育2 h，1×TBS洗膜，用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)檢測和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活性

MTT結(jié)果顯示， GZWM-051能顯著抑制HEL及K562細(xì)胞的增殖活性，GZWM-051處理HEL、K562細(xì)胞72 h時(shí)的IC50值分比為(0.06±0.01)及(1.45±0.28)μmol/L，均<2 μmol/L； GZWM-051以劑量依賴的方式顯著抑制HEL細(xì)胞的增殖活性，且GZWM-051處理濃度為0.20 μmol/L時(shí)、對HEL細(xì)胞增殖活性的抑制能力強(qiáng)于陽性對照試劑PKC-412(圖1)。

圖1 不同濃度GZWM-051處理HEL細(xì)胞的生存曲線Fig.1 HEL cell proliferation in the presence of different concentrations of GZWM-051

2.2 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，處理24及48 h時(shí)，各GZWM-051濃度組的HEL細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；48 h時(shí)的各GZWM-051濃度組HEL細(xì)胞凋亡率顯著高于24 h各GZWM-051濃度組(圖2)。Hoechst33258染色后，凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)皺縮而發(fā)生的高亮，且GZWM-051化合物對HEL細(xì)胞處理的濃度越高，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越明顯(圖3)。

2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，0.05、0.10 μmol/L GZWM-051組HEL細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平較陰性對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各GZWM-051濃度組及陰性對照組細(xì)胞凋亡效應(yīng)蛋白Casepase-3表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各GZWM-051濃度組Cleaved Casepase-3表達(dá)水平較陰性對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

3 討論

2017年，米哚妥林(Midostaurin，PKC-412)被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床靶向FLT3治療AML[5]。而本研究結(jié)果顯示化合物GZWM-051對HEL細(xì)胞的抗增殖活性強(qiáng)于PKC-412，并且GZWM-051對HEL細(xì)胞的IC50值僅為(0.06±0.01)μmol/L，提示微量的化合物GZWM-051即可顯著抑制白血病細(xì)胞HEL的增殖。MTT法檢測結(jié)果顯示，化合物GZWM-051以劑量依賴方式明顯抑制HEL細(xì)胞的增殖活性。不僅如此，化合物GZWM-051也對慢性髓系白血病細(xì)胞K562有著較好的抑制增殖活性，IC50值僅為(1.45±0.28)μmol/L，提示化合物GZWM-051具有重要的潛在臨床應(yīng)用前景。

1972年，科學(xué)家用電子顯微鏡研究組織時(shí)觀測到與創(chuàng)傷性細(xì)胞死亡不同的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[11]。細(xì)胞凋亡，也稱為程序性細(xì)胞死亡，是發(fā)生在多細(xì)胞動物中高度調(diào)控和受控的過程，其特征是細(xì)胞形態(tài)改變、死亡。形態(tài)學(xué)變化包括氣泡、細(xì)胞收縮、核碎裂、染色質(zhì)凝結(jié)、染色體DNA碎裂和整體mRNA衰減。細(xì)胞凋亡可通過兩種途徑啟動——線粒體途徑(內(nèi)源性途徑)和死亡受體途徑(外源性途徑)，這兩種途徑都是通過激活Caspase導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12-14]。Caspase是一類在細(xì)胞程序性死亡和炎癥中起重要作用的蛋白酶，所有已知的Caspase都具有一個半胱氨酸活性位點(diǎn)，并在Asp-XXX鍵上(即天冬氨酸殘基之后)裂解底物[15]。研究已發(fā)現(xiàn)Caspase酶有1 500多種底物，并且數(shù)量將會越來越多[16]。Caspase的激活確保細(xì)胞成分以可控的方式降解，在對周圍組織影響最小的情況下導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的一種終末剪切酶(凋亡效應(yīng)蛋白)，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用[18-19]。需要注意的是，凋亡信號通路激活后，Caspase-3需要被裂解成為Cleaved Caspase-3才能發(fā)揮其剪切活性[20]。在本研究中，化合物GZWM-051促使HEL細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平下調(diào)，其剪切體Cleaved Caspase-3表達(dá)水平上調(diào)，說明化合物GZWM-051通過激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族由一組同源蛋白組成，同源區(qū)域目前發(fā)現(xiàn)有4個(BH1、BH2、BH3及BH4); Bcl-2家族可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生和細(xì)胞對抗癌治療的反應(yīng)等方面具有重要的作用[21]。Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，作用于線粒體膜通透性，抑制細(xì)胞色素C的釋放[12,22-23]。細(xì)胞色素C在凋亡過程中起中間作用，參與激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-9，而Caspase-9可以繼續(xù)激活Caspase-3和Caspase-7，從而引起細(xì)胞凋亡[12,24]。本研究顯示，0.025 μmol/L化合物GZWM-051處理24 h即可誘導(dǎo)HEL細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞的增殖?；衔颎ZWM-051誘導(dǎo)HEL細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，提示化合物GZWM-051通過內(nèi)源性途徑，提高線粒體膜通透性，增加細(xì)胞色素C的釋放，激活凋亡下游通路，觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

注：A、B為GZWM-051處理24 及48 h，C為柱狀圖；(1)與DMSO組比較，P<0.01。圖2 不同濃度GZWM-051處理HEL細(xì)胞24及48 h時(shí)的細(xì)胞凋亡檢測(流式細(xì)胞術(shù))Fig.2 Compound GZWM-051 promoted HEL cell line apoptosis

圖3 不同濃度GZWM-051處理HEL細(xì)胞后細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(Hoechst33258染色，×200)Fig.3 Apoptosis of HEL cell line induced by compound GZWM-051

注：(1)與陰性對照組比較，P<0.01。圖4 不同濃度GZWM-051處理HEL細(xì)胞后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig.4 Compound GZWM-051 affected relevant protein expression level of HEL cell

綜上所述，雙吲哚馬來酰亞胺衍生物GZWM-051具有良好的抗白血病活性，是白血病患者的潛在治療藥物，其通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平和激活Caspase-3剪切體水平誘導(dǎo)HEL細(xì)胞凋亡。