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        基于間充質干細胞的抗菌治療及展望

        2019-10-11 03:08:54朱冬振李美蓉姜玉峰付小兵
        感染、炎癥、修復 2019年2期
        關鍵詞:充質預處理抗菌

        朱冬振 李美蓉 姜玉峰 付小兵

        (1.解放軍總醫(yī)院基礎醫(yī)學所創(chuàng)傷愈合和細胞生物實驗室,北京 100853;2.戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學中心創(chuàng)面治療中心,北京 100101)

        間充質干細胞(MSCs)是一種自我更新的多能細胞,具有巨大的再生醫(yī)學和組織工程應用潛能。MSCs分布于骨髓及其他器官間質內,包括脂肪組織,牙髓,產后組織如臍帶、胎盤或經血[1-5]。間充質和組織干細胞委員會和國際細胞療法學會(ISCT)對人MSCs定義的最低標準是:①黏附性;②表達特異性表面抗原,如表達CD105、CD73和CD90,不表達CD45、CD34、CD14或CD11b(均不表達或只表達其中之一)、CD79a或CD19(均不表達或吸表達其中之一)以及人類白細胞抗原-DR;③體外培養(yǎng)條件下,具有向骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化的多向分化潛能[6]。MSCs還具有損傷組織的趨化性及低免疫原性,使其成為細胞治療的有力工具[5]。目前,在由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)臨床試驗網站ClinicalTrails.gov(https://www.clinicaltrials.gov/)上注冊的基于MSCs的臨床試驗超過500項。

        雖然,體內外實驗闡明了MSCs的生物效應和再生特性,但是其具體機制仍然未知。目前普遍認為MSCs發(fā)揮作用的機制之一是通過旁分泌作用,比如通過釋放生長因子、細胞因子和趨化因子等活性物質發(fā)揮其生物學效應[7]。研究顯示,MSCs具有很強的抗菌效應[8-17],包括間接抗菌作用和直接抗菌作用。其中間接抗菌作用主要是通過調節(jié)宿主對抗原的免疫應答,尤其是調節(jié)免疫系統促炎和抗炎效應的動態(tài)平衡[18],以及增強吞噬細胞的活性來完成[10,13,16];而直接抗菌作用主要是通過分泌抗菌肽(AMPs)[11-12,14,17],以及表達吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)[8]和IL-17[19]來完成。同時,MSCs已經被證實在膿毒癥[9-12,14,16]、急性呼吸窘迫綜合征[13,17]和囊性纖維壞死感染[14]的前臨床模型中,都具有很強的細菌清除能力。為此,我們將目前關于MSCs的直接抗菌作用,尤其是MSCs源性的AMPs作用的研究進展綜述如下,闡述能夠調節(jié)這些AMPs表達和分泌并且增強其抗菌效應的機制。

        1 AMPs的抗菌機制

        AMPs是進化保守的基因編碼小效應分子,部分AMPs是機體構成性存在的,而另一部分則可能是由于感染或炎癥誘發(fā)而產生。AMPs具有廣泛的抗菌作用和免疫調節(jié)效應,可以選擇性地對抗細菌、酵母菌、真菌、病毒,甚至是癌細胞[20]。AMPs通過不同的作用機制發(fā)揮清除微生物的作用,同時一些AMPs也受pH、AMPs自身濃度和鹽濃度等多種因素的影響[20-21]。人類AMPs主要通過與細胞表面和細胞內的不同分子靶點相互作用來發(fā)揮效應。AMPs介導的殺菌機制通過破壞細胞膜的完整性,抑制蛋白質DNA和RNA的合成,以及和某些細胞內的靶點相互作用來發(fā)揮抗菌作用[20]。AMPs通常只對一類抗原發(fā)揮作用,比如細菌或真菌,也有一些AMPs可同時對幾種微生物發(fā)揮作用[22],還有一些特殊的AMPs可作用于對傳統抗生素耐藥的多重耐藥菌,對其發(fā)揮殺傷作用。盡管在臨床使用和商業(yè)化過程中,AMPs仍然有很多問題需要解決,如給藥途徑、潛在的毒性、穩(wěn)定性和較高的生產成本,但這些問題也無法阻止AMPs成為藥物開發(fā)的熱點[23]。AMPs除了具有直接殺菌作用外,其間接生物學效應也有助于控制感染[24]。上皮細胞分泌的AMPs具有多種生物學特性,包括細胞因子和抗內毒素活性、抑制蛋白酶、細菌調理和促血管生成特性[24]。

        目前研究表明,MSCs主要表達4種AMPs:LL-37[11,14]、人β-防御素-2(hBD-2)、鐵調素(hepcidin)[12]和脂質運載蛋白-2(Lcn2)[17],并且在感染及炎癥狀態(tài)下,這些AMPs可被進一步調節(jié),以增強細菌清除率。MSCs發(fā)揮抗菌作用可能部分與這4種類型的AMPs有關。其中,LL-37對巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞具有趨化性[25]。LL-37也被證明具有中和脂多糖(LPS)的效應,在膿毒癥小鼠模型中顯示出抗感染性休克的作用[26]。β-防御素也有類似LL-37的作用,這可能由CC趨化因子受體6(CCR6)途徑介導[27]。而鐵調素和Lcn2[17]主要通過調節(jié)細菌生長所必需的鐵的利用來發(fā)揮作用[17,28]。

        2 MSCs抗菌效應的體外研究

        MSCs抗菌特性的研究大多數來自于體外實驗,且很少有關于MSCs對病毒、真菌和寄生蟲作用的研究[29]。由AMPs介導的不同來源MSCs的抗菌效應、作用機制和抗菌范圍已有所研究。MSCs可以針對特定類型抗原產生最有效AMPs的特異性應答,且小鼠和人MSCs的抗菌作用機制存在種屬差異性。不同來源的MSCs中檢測到和未檢測到的AMP類型見表1。

        表1 不同MSCs來源的AMP類型

        目前,骨髓間充質干細胞(BMSCs)促進糖尿病創(chuàng)面愈合已得到大量實驗的證明[30-31],其抗菌特性的研究也最為廣泛。人類BMSCs的抗菌效果是由LL-37[11,14]和鐵調素[12]介導的。在受到刺激和未受到刺激的BMSCs中均能檢測到AMPs。Krasnodembskaya等[10]的研究表明,BMSCs本身或其條件培養(yǎng)基均能夠抑制細菌生長,但前提是BMSCs必須經過細菌預處理。另外,人防御素-2(hBD-2)、hBD-3、Lcn2和表面蛋白D(SPD)在BMSCs中不表達或者含量極低,不具備抗菌效果。近來,Sutton等[14]的研究表明,BMSCs主要分泌LL-37,在體外發(fā)揮很強的抗銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌作用,并控制細菌生長速率和轉化成集落形成單位。這些數據表明,AMPs可能成為傳統抗生素有效的輔助藥物。并且,在受到炎癥刺激如采用γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-1 β(IL-1 β)或IL-12預處理后,BMSCs分泌LL-37的水平升高[11-12]。相關的研究顯示,受到刺激和未受到刺激的BMSCs均未檢測到hBD-2和hBD-3的表達[14]。值得注意的是,BMSCs只有在胎牛血清培養(yǎng)基環(huán)境中才能檢測到LL-37,而在無血清和血小板裂解產物培養(yǎng)條件下,BMSCs的抗菌效能和產生LL-37能力下降[14]。BMSCs發(fā)揮抗菌特性不僅局限在AMPs的活性方面,實際上,經過炎癥因子刺激,BMSCs中IDO表達大量增加,并能夠針對臨床相關細菌、寄生蟲和病毒發(fā)揮自主廣譜的抗菌效果[8]。此外,研究顯示,IL-17陽性小鼠BMSCs具有較強的抗真菌活性[19]。IL-17對白色念珠菌的抑制呈現劑量依賴性,而抗IL-17抗體能部分降低小鼠BMSCs抗白色念珠菌的能力[19]。小鼠BMSCs具有對大腸桿菌和白色念珠菌的抗菌效應潛能,但和人類BMSCs相比,其發(fā)揮抗菌效應的作用機制不同。Balan等[32]的研究結果顯示,大腸桿菌預處理的小鼠BMSCs, Lcn2的產生顯著增加,但并未檢測到LL-37的分泌[17]。此外,與人的BMSCs相比,小鼠BMSCs即使在炎癥因子如IFN-γ、IL-1β或IL-12的刺激下,也不能表達IDO,因此它們對細菌沒有抑制作用[8]。但是也有報道顯示,未受到刺激的小鼠BMSCs對大腸桿菌或金黃色葡萄球菌有直接的吞噬作用,并且呈現劑量依賴性[16],這一說法仍需進一步驗證。

        由于經血來源的間充質干細胞(MenSCs)可采用非侵入方式收集,并具有能夠保證細胞數量及相同的遺傳背景等優(yōu)點,有望成為細胞治療的另一種具有吸引力的細胞源[2]。MenSCs能夠通過分泌鐵調素發(fā)揮重要的抗菌作用。多種細菌均能夠增加MenSCs中鐵調素的表達,而其他AMPs,如LL-37和hBD-1-2-3仍然低于檢測限[12]。在缺氧條件,鐵調素下調會導致MenSCs的抗菌性能喪失,也表明了其鐵調素依賴的抗菌機制[12]。從這個角度來看,缺氧對MenSEs功能的影響可以被認為是其抗菌活性的負調節(jié)劑,但缺氧本身又可以增強MenSEs的促血管生成作用[2]。因此,培養(yǎng)條件對于MenSCs的生物學效應非常重要。然而,缺氧對于MSCs的調節(jié)作用在很大程度上取決于MSCs的來源,比如有研究表明,低氧條件下,并不改變AT-MSCs的免疫抑制能力[33]。

        Sung等[34]的研究顯示,臍帶間充質干細胞(UCMSCs)或細菌預處理后的UC-MSC來源條件培養(yǎng)基均能夠顯著抑制大腸桿菌的生長。基因表達譜分析顯示,大腸桿菌刺激后,UC-MSCs中Toll樣受體-2(TLR-2)和TLR-4以及hBD-2顯著上調,提示MSCs可能通過TLR信號通路分泌hBD-2來發(fā)揮抗菌作用。特異性拮抗或沉默TLR-4后,反應性的hBD-2增高消失,MSCs的體外抗菌作用降低。額外補充hBD-2可恢復MSCs的體外抗菌作用,進一步提示MSCs的抗菌效果僅通過TLR-4途徑分泌hBD-2介導。在該研究中,其他AMPs(如LL-37或Lcn2)的水平并未顯著上調。

        此外,AT-MSC或其條件培養(yǎng)基也顯示出抗微生物作用。Sutton等[14]報道,AT-MSCs的條件培養(yǎng)基將銅綠假單胞菌生長速率降低的作用與遺傳霉素(一種廣譜氨基糖苷類抗生素)的作用相當。重要的是,AT-MSC結合遺傳霉素顯示出對銅綠假單胞菌的有效抗菌作用,揭示了這種類型的間充質干細胞具有增強抗生素效能的作用。

        3 MSCs抗菌效應的體內研究

        MSCs在體外的抗菌能力在體內也得到證實。不同來源MSCs能夠減輕不同臨床前模型中收集到的血液、脾臟、腹膜、肺和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中病原體的負載,并且與給藥途徑、劑量或注射時間無關[9-17]。

        在大腸桿菌肺炎的免疫活性模型中,BMSCs處理后能夠明顯降低肺勻漿(LH)和BALF中的總細菌數量[11]。并且,BMSCs處理組中BALF細胞計數和絕對中性粒細胞計數也較低,表明BMSCs處理的小鼠不依賴于免疫細胞的募集來清除細菌。另外,中和LL-37抗體能夠拮抗BMSCs的體內抗菌效果,這表明BMSCs的體內抗菌活性需要依賴LL-37發(fā)揮作用[11],這些結果與Sung等[34]的研究結果一致。Sung等[34]的研究顯示,同樣在大腸桿菌肺炎的免疫活性模型中,注射UC-MSCs會引起炎癥反應下調和細菌清除率增加,增加BALF中的hBD-2分泌,并增強由此產生的對大腸桿菌誘導的肺炎的保護作用。由于MSCs分泌的hBD-2是通過TLR-4途徑介導,因此UC-MSCs的抗菌效果可被TLR-4 siRNA轉染的UC-MSC所消除[34]。此外,另一類似臨床前模型研究證明,小鼠BMSCs移植后,BALF中抗菌分子Lcn2的濃度增加,并且使用單克隆抗體阻斷Lcn2會導致MSCs體內實驗抗菌效果喪失[17]。

        在盲腸結扎穿孔(CLP)誘導產生的多微生物敗血癥的免疫活性小鼠模型中,人或小鼠來源MSCs的移植顯著減輕了病原體的負載,并顯著改善了小鼠存活率[9,12,16,35]。另外,穿刺誘導的膿毒癥模型中,移植MenSCs后,能夠降低動物死亡率,同時能夠改善器官功能障礙,調節(jié)炎癥反應,促進血液中的細菌清除,這與抗生素治療效果相當[12]。并且,MenSCs與抗生素聯合能夠起到協同作用,進一步提高生存率[12]。此外,Gonzalezrey等[9]研究顯示,AT-MSC處理的膿毒癥小鼠具有比未經AT-MSC處理小鼠更低的腹膜細菌計數,表明AT-MSC可通過自身或通過活化其他細胞來增強機體的抗菌性。

        囊性纖維化病是一種遺傳性疾病,其中肺部感染和炎癥是造成其發(fā)病和死亡的主要原因。在囊性纖維化病的小鼠模型中,感染銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌后,進行BMSCs或其條件培養(yǎng)基移植,能夠明顯減少BALF中上述兩種病原體的細菌菌落計數。目前,尚未見LL-37的體內抗菌效應的報道,但是體外的數據都顯示它們具有在體內抑菌的潛能[14]。

        4 前景和挑戰(zhàn)

        目前,除通過輸注MSCs或者直接給予合成或天然AMP方式提高機體的抗菌性外,一些研究還希望通過膳食營養(yǎng)素和維生素調節(jié)體內內源性細胞的AMP表達,以促進先天免疫反應[36]。已有研究顯示,維生素D3可直接調節(jié)人抗微生物肽LL-37和hBD-2的表達[37-38]。最近的一項研究顯示,ICU中進行機械通氣的患者中,使用高劑量維生素D3能夠縮短住院時間,但血漿LL-37濃度或其他臨床結局無明顯變化[39]。維生素D具有刺激MSCs成骨的潛能[40]。這就需要體內外的實驗進一步確定維生素D對MSCs的生物學效應。鑒于MSCs在機體中分布廣泛,所以,刺激內源性MSCs中AMP分泌是提高機體自身抗菌效能的具有前景的策略。

        隨著耐藥菌株的不斷增加,臨床迫切需要新的抗菌策略。發(fā)現新類別的抗菌藥物或AMP非常具有應用前景,但這不是對抗耐藥菌株的唯一策略。事實上,提高AMP的輸送效率、生物利用度、體內釋放和吸收,同時減少其清除和不良反應,都可以成為擊敗耐藥菌株的助力器。而MSCs本身就可以顯著改善AMP的藥代動力學。它通過感應機體變化,發(fā)出釋放AMP的信號,并能夠趨化到損傷部位,在感染部位持續(xù)釋放AMP,并且釋放的AMP的種類與所受到的刺激相關。因此,專注于增強MSC的抗菌功能,可能更有利于其體內的抗菌效能。

        5 結 論

        MSCs通過間接和直接機制發(fā)揮強烈的抗微生物作用,部分機制是通過分泌AMP來實現的。在特定預處理后,可以進一步增強其在包括膿毒癥[9-12,14,16]、急性呼吸窘迫綜合征[13,17]和囊性纖維壞死感染[14]中的抗菌效應。這些證據都揭示了MSCs具有顯著的抗菌效應,進一步增加MSCs中AMP的表達和分泌以增強其抗菌效能,是現實可行的抗菌策略。在不同的前臨床模型中,MSCs預處理可提高MSCs源性AMPs的表達,從而增強細菌清除能力[9-14,16]。目前已知的預處理方式包括細胞因子、生長因子和UVB光刺激。隨著研究的進展,應該會發(fā)現更為有效的預處理方式及更加有效的聯合抗菌方案。

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