韓疏影, 宋易霖, 康 安, 鄧海山, 朱 棟, 池玉梅

(南京中醫(yī)藥大學藥學院, 江蘇 南京 210023)

雙酚A(BPA)是生產(chǎn)聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的中間體[1],早期被廣泛用于制作塑料水杯、餐具、嬰兒奶嘴、飲料及奶粉罐的內(nèi)襯。研究表明,雙酚A是一種內(nèi)分泌干擾物質(zhì),會從食品塑料包裝材料遷移到食品中,并被人體吸收[2]。因此,加拿大、歐盟和美國已禁止在嬰兒水杯中使用BPA[3]。隨后,一系列雙酚類物質(zhì)(BPs)出現(xiàn)并應用于塑料工業(yè),如雙酚B(BPB)、四甲基雙酚A(TMBPA)、雙酚C(BPC)、雙酚P(BPP)、雙酚Z(BPZ)、雙酚芴(BPFL)、雙酚AF(BPAF)和雙酚AP(BPAP)等[4-7]。該類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與雙酚A類似,具有慢性毒性、基因毒性及雌激素樣活性[8,9]，但目前對其研究甚少[10,11]。迄今尚未見同時檢測以上9種雙酚類物質(zhì)的相關報道。

國家標準GB/T 5009.156-2016規(guī)定,通過浸出實驗可實現(xiàn)水杯中雙酚類物質(zhì)的檢測。使用大體積模擬樣品對雙酚類物質(zhì)浸出后,需進行富集濃縮才可進行后續(xù)分析。用于BPs富集的傳統(tǒng)前處理方法主要有液液萃取法[12]和固相萃取法[13],但這些方法有機溶劑消耗量大,易造成環(huán)境污染。隨后,一些微萃取技術,如固相微萃取[14]、分散液液微萃取[15]和超分子溶劑微萃取[16-18]被用于檢測雙酚A,以實現(xiàn)儀器微型化和實驗綠色化。但這些實驗器材多為塑料材質(zhì),其中含有的雙酚類物質(zhì)會嚴重干擾低濃度水平下雙酚類物質(zhì)檢測的準確性[19]。高度自動化的在線富集前處理技術,可將樣品富集后直接分離檢測,可簡化實驗步驟,縮短分析周期;避免樣品污染,減少實驗誤差;降低樣品損失,提高分析靈敏度。

本文以塑料兒童水杯浸出液中可能含有的9種雙酚類物質(zhì)作為分析對象,建立了自動在線富集與高效液相色譜-熒光檢測(online enrichment-HPLC-FLD)的方法,以簡化復雜的樣品前處理流程,如水體富集和凈化步驟,且使用熒光檢測器即可獲得與質(zhì)譜法檢測相近的靈敏度[20],使水體中新型BPs的實時監(jiān)測成為可能。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Fisher Ultimate TM3000高效液相色譜儀,配有DGP-3600RS雙三元泵、帶六通閥的TCC-3000柱溫箱、FLD-3400RS熒光檢測器和Chromeleon 7.10工作站(賽默飛世爾科技有限公司,美國); KH-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(禾創(chuàng)超聲儀器有限公司,中國); MS-105DU電子分析天平(梅特勒托利多,瑞士)。

BPA(純度>99%)、BPZ(純度>98%)、BPFL(純度>98%)、BPAP(純度>99%)購自上海麥克林生物化學試劑有限公司;BPB(純度>95%)購自美國Ark Pharm公司;BPAF(純度>99%)購自北京百靈威科技;BPP(純度>98%)和BPC(純度>98%)購自日本Tokyo Chemical Industry公司;TMBPA(純度>98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲醇購自德國默克公司(達姆施塔特);娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團。

1.2 標準溶液配制

精密稱定9種雙酚類物質(zhì)各0.01 g,分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得1 g/L各對照品儲備液;分別準確量取各對照品儲備液適量,置于50 mL容量瓶中,用5%(v/v)甲醇水溶液定容,得混合對照品儲備液(BHFL為0.1 g/L, BPA和BPB為0.1 mg/L,其他物質(zhì)均為1.0 mg/L)。各對照品儲備液和混合對照品儲備液均在4 ℃下儲存。

移取混合對照品儲備液，逐級稀釋,得BPA和BPB質(zhì)量濃度為0.4、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0和80.0 ng/L, BPFL質(zhì)量濃度為0.2、0.4、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0和80.0 μg/L,其他雙酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為2.0、4.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0和800.0 ng/L的系列工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

以不含BPs的去離子水作為空白溶劑配制實驗用溶液,且實驗過程中均使用玻璃器皿,以避免BPs從塑料實驗器皿中浸出,影響檢測結(jié)果的準確度[20]。

1.3 樣品前處理

購買10個聚碳酸酯兒童水杯,分別標注為1～10號,于25 ℃烘箱中干燥至恒重(每隔3 h稱重一次,以連續(xù)兩次干燥的重量差異在各水杯質(zhì)量的萬分之三以內(nèi)為恒重),測定水杯的高度(測定高度的上緣至水杯上邊緣的距離不超過1 cm)和平均直徑,估算其接觸面積。根據(jù)GB/T 5009.156-2016規(guī)定,按接觸面積以1.5 mL/cm2取相應體積的100 ℃熱水傾入杯中,蓋上表面皿,置于100 ℃烘箱中恒溫4 h,避光冷卻至室溫后即為水杯浸出液。

取5 mL浸出液進樣分析,以各物質(zhì)的保留時間(tR)作為檢定物質(zhì)的依據(jù),tR偏差在2.5%范圍內(nèi)可視為同一物質(zhì),并根據(jù)標準曲線計算各水杯浸出液中雙酚類物質(zhì)的含量。剩余溶液轉(zhuǎn)移至玻璃錐形瓶中,儲存于4 ℃冰箱中,當水樣中雙酚類物質(zhì)含量超出線性范圍時,取剩余浸出液稀釋至符合線性范圍,再進樣分析。

1.4 在線富集分析與高效液相色譜-熒光檢測條件

在線富集分析系統(tǒng)示意圖見圖1,六通閥切換條件為0～7.0 min時,六通閥為1-6位; 7.0～9.8 min時,六通閥切換至5-6位; 9.8～24.0 min時,六通閥切換回1-6位。

高效液相色譜-熒光檢測條件:分析柱為Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,沃特世科技有限公司,美國);富集柱為Kromosil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm,漢邦科技有限公司,中國);柱溫為30 ℃;流動相為(A)甲醇和(B)水;流速為0.9 mL/min;進樣量為5 mL。采用的熒光激發(fā)波長與發(fā)射波長(λEx/λEm)為BPFL 230/319 nm, PA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA 228/306 nm。梯度洗脫程序見表1。

圖 1 在線富集分析系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic diagrams of online enrichment and analysis system

表 1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

表 2 9種雙酚類物質(zhì)的最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長Table 2 Optimal excitation (λEx) and emission (λEm) wavelengths of the nine bisphenols

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的建立

2.1.1熒光波長的選擇

9種雙酚類物質(zhì)的最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長(λEx/λEm)見表2。若設定9個最佳λEx/λEm同時采集,則基線噪音增大,導致各物質(zhì)的檢測靈敏度降低。如表2所示,9種物質(zhì)的最佳λEx/λEm相近,故選用9種雙酚類物質(zhì)的平均λEx/λEm采集熒光信號。結(jié)果表明,BPFL在此條件下響應信號強度明顯降低。因此,設置BPFL的最佳λEx/λEm(230/319 nm)采集其熒光信號,而對BPA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA則采用平均λEx/λEm(228/306 nm)采集其熒光信號。

2.1.2洗脫與分離條件的優(yōu)化

參照文獻[21],本實驗首先固定富集流動相為甲醇-水(5∶95, v/v),富集時間為5 min。在此條件下進行洗脫與分離條件的優(yōu)化。為減小峰展寬,縮短分析時間,同時避免富集柱上的強保留雜質(zhì)被洗脫至分析柱上,在保證所有目標物完全轉(zhuǎn)移至分析柱的前提下,反沖時間應盡可能短。設Vf=tf×F、Vc=π×r2×L,其中，Vf和Vc分別為反沖體積和富集柱體積(mL)、tf為反沖時間(min)、F為流動相體積流速(mL/min)、r為色譜柱內(nèi)徑(cm),L為色譜柱長(cm)。當Vf≥Vc時,可使目標物轉(zhuǎn)移至分析柱;當Vf=Vc時,得最短反沖時間為2.8 min。

實驗考察了乙腈-水和甲醇-水體系對9種雙酚類物質(zhì)的洗脫和分離能力,并優(yōu)化洗脫和分離的流動相條件。結(jié)果表明,當洗脫流動相為甲醇-水,且以表1中右泵梯度程序洗脫時,各目標分析物可實現(xiàn)基線分離。

圖 2 不同富集時間對雙酚類物質(zhì)富集效率的影響(n=3)Fig. 2 Effect of enrichment time on the enrichment efficiencies of the nine bisphenols (n=3)

2.1.3富集條件的優(yōu)化

實驗同樣對富集過程中的富集流動相比例以及富集時間進行了優(yōu)化?？紤]本實驗需除去水溶性雜質(zhì),保留疏水性較高(lgKow>3.295[22])的雙酚類物質(zhì),因此以甲醇-水(5∶95, v/v)作為富集流動相,以0.9 mL/min的流速將樣品帶入在線富集柱,淋洗雜質(zhì)并富集待測物,以減少待測組分的損失,提高結(jié)果的準確度。同時,采用與富集流動相組成相同的5%(v/v)甲醇水溶液溶解樣品,以減少大體積進樣(5 mL)產(chǎn)生的溶劑效應對富集效果的影響。

實驗對富集時間進行了優(yōu)化(見圖2)。結(jié)果表明,在2～7 min時,富集效率隨著富集時間增加而增加;7 min后,BPAP、BPC、BPFL及BPP的富集效率隨富集時間的增加而減小,可能原因是這些雙酚類物質(zhì)疏水性相對較弱,用高水相比例的富集流動相長時間淋洗后,導致部分樣品被洗脫;當富集時間增至8.3 min時,TMBPA在HPLC系統(tǒng)內(nèi)的保留時間大大增加(>25 min),使分析周期延長,降低分析效率。因此,實驗選擇7 min作為富集時間。

以優(yōu)化后的富集、洗脫和分離條件對9種雙酚類物質(zhì)進行在線富集分析檢測,結(jié)果見圖3,各物質(zhì)間均達到基線分離,在激發(fā)/發(fā)射波長為228/306 nm和230/319 nm時，基質(zhì)中的雜質(zhì)對分析結(jié)果均無影響,分離效果良好。

圖 3 空白對照品溶液、混合對照品溶液和7號水杯 浸出液在不同檢測波長下的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the blank standard solution, mixed standard solutions and extracted solution of bottle No. 7 Mass concentrations: 40 ng/L for BPA and BPB; 400 ng/L for BPAF, BPAP, BPC, BPZ, BPP and TMBPA; 40 μg/L for BPFL. Peak identifications: 0. unknown impurity; 1. BPA; 2. BPB; 3. BPAF; 4. BPAP; 5. BPC; 6. BPFL; 7. BPZ; 8. BPP; 9. TMBPA.

2.2 方法學考察

按歐盟非強制執(zhí)行法案2002/657/EC,考察所建分析方法的專屬性、線性范圍、準確度、精密度、穩(wěn)定性、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

2.2.1專屬性

在建立的色譜條件下,各物質(zhì)的分離度為1.20～4.46,雜質(zhì)峰與待測物質(zhì)峰間亦可達基線分離(1.77～2.04),說明該方法專屬性良好。

2.2.2線性范圍、檢出限和定量限

取每日配制的標準工作溶液,以各待測物的色譜峰面積對質(zhì)量濃度繪制標準曲線,線性回歸方程和相關系數(shù)(r2)見表3。9種雙酚類物質(zhì)在各自范圍內(nèi)均呈良好的線性關系,相關系數(shù)均大于0.998,符合含量測定要求。以3倍和10倍信噪比(S/N)對應的雙酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限,得各雙酚類物質(zhì)的LOD與LOQ見表3。

表 3 9種雙酚類物質(zhì)的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Regression equations, linear ranges, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the nine bisphenols

Y: peak area;X: mass concentration, ng/L.

表 4 9種雙酚類物質(zhì)的日間、日內(nèi)精密度、加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Intra-day precisions, inter-day precisions, spiked recoveries and relative standard deviations of the nine bisphenols (n=6)

Low, medium and high levels: 2, 20 and 40 ng/L for BPA and BPB; 2, 20 and 40 μg/L for BPFL; 20, 200, 400 ng/L for BPAF, BPAP, BPC, BPZ, BPP and TMBPA.

2.2.3精密度與準確度

分別移取2、20、40 ng/L BPA和BPB, 2、20、40 μg/L BPFL及20、200、400 ng/L BPAF、BPAP、BPC、BPZ、BPP和TMBPA低、中、高3個水平的樣品3份,于3 d內(nèi)每天進樣6針,以峰面積的值計算相對標準偏差(n=6),考察日內(nèi)及日間精密度(見表4)。結(jié)果表明,日內(nèi)精密度為0.4%～9.6%;日間精密度為0.5%～10.2%。

取上述低、中、高3份樣品各5 mL,向其中分別加入0.5、1.0和2.0倍水平的標準工作溶液5 mL,每個加標水平樣品平行6份,分別測定并計算回收率和相對標準偏差,結(jié)果見表4。9種雙酚類物質(zhì)的加標回收率為90.7%～112.4%, RSD為0.9～11.3%,表明該方法的精密度和準確度均符合含量測定要求。

2.2.4穩(wěn)定性

將新鮮配制的中等水平對照品溶液分成兩份,分別于4 ℃和25 ℃條件下儲存,自配制時刻起于0、12、24、48和72 h進樣測定,計算峰面積的RSD,并用12、24、48和72 h時物質(zhì)的峰面積與0 h時的峰面積(計為100%)比較,以表征物質(zhì)的降解趨勢(見圖4)。在低溫條件下(4 ℃), 72 h內(nèi)9種雙酚類物質(zhì)峰面積的RSD為0.4%～10.4%,表明這9種物質(zhì)在低溫狀態(tài)下性質(zhì)穩(wěn)定;而當溫度升至25 ℃時,BPA、BPB、BPAF、BPAP、BPC、BPFL、BPZ和TMBPA的峰面積于72 h后明顯降低(>10%),說明常溫下9種雙酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性降低。因此,所有工作溶液需當天配制使用,并于4 ℃冰箱內(nèi)儲存。

圖 4 25 ℃下9種雙酚類物質(zhì)在72 h內(nèi)的降解趨勢圖(n=3)Fig. 4 Degradation trends of the nine bisphenols in 72 h at 25 ℃ (n=3)

表 5 市售兒童水杯中9種雙酚類物質(zhì)的檢出量Table 5 Contents of the nine bisphenols in children’s water bottles from markets mg/kg

+ the content was under LOQ; / the content was not detected.

2.3 兒童水杯浸出液中9種雙酚類物質(zhì)的檢測

2.3.1含量測定

采用所建方法檢測兒童水杯浸出液中9種雙酚類物質(zhì)的含量(見表5)。計算公式為雙酚含量=n×c×Δm/(m0×ρ),其中,n為稀釋倍數(shù),c為計算的待測物含量(ng/L),m0為兒童水杯的質(zhì)量(g), Δm為浸出液的質(zhì)量(g),ρ為水的密度(g/cm3)。結(jié)果表明,90%的水杯有較高含量的BPA(>0.6 mg/kg,歐盟條例2004/19/EC規(guī)定,雙酚A的遷移量不得超過0.6 mg/kg); BPB、BPC、BPAF和TMBPA等雙酚類物質(zhì)的檢出率分別為30%、50%、30%和20%(檢出量>LOQ的水杯數(shù)占總水杯數(shù)的比例),其檢出量遠低于BPA的檢出量,表明目前塑料兒童水杯中的雙酚類化合物仍以BPA為主。因此本文所建方法不僅可以有效監(jiān)測水樣中多種雙酚類物質(zhì),也可用以評估和監(jiān)控BPA替代品的使用趨勢。此外,由于BPFL的熒光吸收較弱,本法對BPFL的檢測靈敏度(LOQ為200 ng/L)低于其他8種物質(zhì),在本文中未有檢出,因此后續(xù)研究將結(jié)合更有效的前處理方法或分析方法，以進一步提高BPFL的檢測靈敏度。

2.3.2兒童水杯浸出液中雙酚類物質(zhì)含量隨使用次數(shù)的變化

為模擬實際生活中兒童水杯循環(huán)使用的情況,按1.3節(jié)方法重復處理1號、7號、9號和10號水杯各5次,每次取100 ℃下恒溫4 h的浸出液分析,以峰面積與浸出液質(zhì)量的比值表征單位質(zhì)量浸出液中雙酚類物質(zhì)的含量,考察兒童水杯的循環(huán)使用次數(shù)對其中雙酚類物質(zhì)浸出量的影響(見圖5)。結(jié)果表明,各物質(zhì)的浸出量整體呈先上升后下降的趨勢,在第2～4次處理時(在100 ℃條件下累計維持4～16 h),浸出量達到最高,在第5次處理時(在100 ℃條件下累計維持20 h),絕大多數(shù)雙酚類物質(zhì)的浸出量約降為新水杯中雙酚類物質(zhì)浸出量的1.0～1.5倍,表明新水杯使用數(shù)次后會釋放出大量雙酚類物質(zhì),隨著使用次數(shù)增加,水杯中雙酚類物質(zhì)浸出量雖然下降,但仍會不斷釋放。隨著浸出時間增加,BPA浸出量下降趨勢最顯著,這可能與BPA在高溫時不穩(wěn)定有關(見圖4);而BPC在1號、7號和9號水杯中的浸出量均基本不變,說明該物質(zhì)在水杯使用過程中穩(wěn)定而持續(xù)釋放,這與其在穩(wěn)定性實驗中表現(xiàn)出的良好穩(wěn)定性一致(見圖4, 25 ℃下72 h內(nèi)基本不降解)。該結(jié)果表明,作為BPA替代物出現(xiàn)的各類BPs,如BPC、BPP和BPAF等,因其良好的化學穩(wěn)定性,反而不易降解,更易隨水杯的使用持續(xù)不斷釋放并遷移。

圖 5 浸泡次數(shù)對水杯中雙酚類物質(zhì)遷移量的影響Fig. 5 Effect of soaking times on the extracted amounts of bisphenols from water bottles Bottles: a. No. 1; b. No. 7; c. No. 9; d. No. 10.

3 結(jié)論

本文采用在線富集與高效液相色譜-熒光檢測聯(lián)用技術,建立了簡便、高效、準確測定水中9種雙酚類物質(zhì)的方法。本方法優(yōu)化了在線富集和分析過程,實現(xiàn)了樣品的在線富集和除雜,避免了繁瑣的樣品前處理過程,大大節(jié)約了實驗時間和成本,且重復性好,準確度高,適用于水中痕量雙酚類物質(zhì)的檢測。將此法用于檢測我國市售兒童水杯的浸出液中9種雙酚類物質(zhì),發(fā)現(xiàn)作為BPA替代物出現(xiàn)的新型BPs,因穩(wěn)定性較BPA高,不易降解,更易隨著水杯的使用持續(xù)不斷釋放并遷移,故使用本文所建方法同時快速監(jiān)測這些雙酚類物質(zhì)具有重要意義。