劉 通, 王玉嬌, 王秀娟, 崔東偉,3, 張 峰*

(1. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院, 天津 300000; 3. 中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 沈陽 110122)

巴氏殺菌乳是僅以生牛(羊)乳為原料,經(jīng)巴氏殺菌等工序制得的液體產(chǎn)品[1]。近年來乳品工業(yè)迅猛發(fā)展,市場上銷售的巴氏殺菌乳品種、規(guī)格頗多。部分乳品企業(yè)為提高產(chǎn)品的“香”、“濃”,會(huì)使用香精等添加劑來增強(qiáng)口味。我國現(xiàn)行的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對巴氏殺菌乳做了明確規(guī)定,不得添加任何香精香料,但目前尚缺乏相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致監(jiān)管缺項(xiàng)。

香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素作為食品添加劑,廣泛用于巧克力、冰淇淋、糕點(diǎn)、糖果和乳制品等食物中,但人體超量攝入會(huì)對身體健康造成危害,如產(chǎn)生頭暈、惡心、呼吸困難,甚至導(dǎo)致肝、腎損傷[2]。香豆素是具有新鮮香草氣味的內(nèi)酯類化合物,在蕓香科和傘形科植物中廣泛存在。毒理實(shí)驗(yàn)表明,香豆素能夠?qū)Ω文I產(chǎn)生中等毒性,從而危害健康,中國、美國、英國和印度等國家禁止香豆素作為食品添加劑添加到食品中。然而香豆素衍生物如7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、二氫香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素和環(huán)香豆素等可能被用作香豆素替代物添加到食品中,進(jìn)而逃避安全監(jiān)管[3-5]?？紤]到香蘭素和香豆素類物質(zhì)的副作用[6],建立其在食品中的同時(shí)檢測方法十分必要。

目前,針對食品中香蘭素和香豆素類致香成分的測定方法主要有氣相色譜法(GC)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8-10]、液相色譜法(LC)[11]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[12-14]和毛細(xì)管電泳法(CE)[15]等。相比液相色譜法,氣相色譜法對應(yīng)的前處理簡單,更易操作,但在復(fù)雜基質(zhì)多組分分析時(shí),氣相色譜法存在靈敏度低和檢出限高的缺點(diǎn)。GC-MS采用選擇離子監(jiān)測(SIM)模式對化合物進(jìn)行確認(rèn),但受樣品基質(zhì)干擾影響,易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。氣相色譜-三重四極桿技術(shù)(GC-MS/MS)是在GC-MS的基礎(chǔ)上增加了二級(jí)質(zhì)譜信息,因此選擇性和抗干擾能力更強(qiáng),定量更準(zhǔn)確。

鄭小嚴(yán)[16]建立了凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定配方奶粉中香蘭素和乙基香蘭素的檢測方法;李長于等[17]建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定香精香料中香豆素和黃樟素的檢測方法,但目前尚未有香蘭素和香豆素以及它們衍生物同時(shí)檢測的方法報(bào)道。本文采用GC-MS/MS技術(shù)建立了巴氏殺菌乳中香蘭素和香豆素以及它們衍生物的同時(shí)檢測方法。該方法前處理操作簡單,靈敏度高,定性定量準(zhǔn)確,可為巴氏殺菌乳中香蘭素和香豆素類香精的精準(zhǔn)測定提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器、試劑與材料

7890A/7000C氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(配備自動(dòng)進(jìn)樣器和電子轟擊電離源,美國Agilent公司),數(shù)據(jù)采集由MassHunter完成;VORTEX KB-3渦旋振蕩器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司); 3-30K高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)。

9種香精標(biāo)準(zhǔn)品:二氫香豆素、香蘭素、香豆素、乙基香豆素、甲基香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-乙氧基-4甲基香豆素和環(huán)香豆素(純度>96%,日本TCI公司)。乙醇、甲醇、乙腈和丙酮(美國Fisher Scientific公司);乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA)(德國Sigma公司);十八烷基鍵合硅膠(C18)(美國Agilent公司);硫酸鎂、無水硫酸鈉(成都市科龍化工試劑廠)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取9種香精標(biāo)準(zhǔn)品(10.0±0.1) mg,分別置于10 mL容量瓶中,加入少許無水乙醇混勻,待標(biāo)準(zhǔn)品溶解,再加入乙醇定容至10 mL,可得1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

分別精密移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL,置于10 mL容量瓶中,用乙醇稀釋并定容至10 mL,可得10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取液體巴氏殺菌乳1 g,置于50 mL離心瓶中,加入15 mL無水乙醇,渦旋1 min,低溫離心(4 ℃, 8 000 r/min)5 min,取1 mL上清液,用0.22 μm尼龍濾膜過濾后,上機(jī)檢測。

1.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取不含目標(biāo)物的空白巴氏殺菌乳樣品1 g(精確至0.01 g),按1.3節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理得到基質(zhì)提取液。用基質(zhì)提取液作為稀釋溶劑制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 GC-MS條件

色譜柱:DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國Agilent公司);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;載氣:氦氣(≥99.999%);流量:1.0 mL/min。程序升溫:初始溫度80 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的速率升溫至170 ℃,保持1 min,以60 ℃/min的速率升溫至270 ℃,保持10 min。進(jìn)樣量:1.0 μL。

色譜-質(zhì)譜接口溫度:280 ℃;電子轟擊電離(EI)源;電子能量:70 eV;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;溶劑延遲:4 min。9種香精化合物的名稱、保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 9種香精成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and MS parameters of the nine flavor compounds

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的考察

升溫程序是實(shí)現(xiàn)化合物分離非常重要的氣相色譜參數(shù),本實(shí)驗(yàn)考察了在升溫的第一階段不同升溫速率(5、10和20 ℃/min)對化合物分離效果的影響。當(dāng)?shù)谝浑A段升溫速度為20 ℃/min時(shí),二氫香豆素和香蘭素保留時(shí)間相近,兩個(gè)化合物難以分開;采用10 ℃/min和5 ℃/min兩種升溫速率可實(shí)現(xiàn)2種化合物的良好分離,考慮到節(jié)約時(shí)間,升溫速率最終選擇10 ℃/min。

2.2 質(zhì)譜條件的考察

三重四極桿質(zhì)譜條件的優(yōu)化參數(shù)一般包括母離子、子離子以及碰撞能量等。在MRM參數(shù)優(yōu)化過程中,先通過全掃描模式選取質(zhì)荷比較大且相對豐度較高的特征碎片作為母離子,然后將母離子進(jìn)一步裂解,選取2～3個(gè)離子作為子離子,最后對每一對母離子/子離子以響應(yīng)信號(hào)大小為依據(jù)優(yōu)化碰撞能量。圖1顯示了9種香精成分的結(jié)構(gòu)圖,在MRM模式下9種香精成分的色譜圖見圖2。

圖 1 9種香精成分的結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structure diagrams of the nine flavor compounds

圖 2 9種香精成分的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of the nine flavor compounds 1. hydrocoumarin; 2. vanillin; 3. coumarin; 4. ethyl vanillin; 5. methyl vanillin; 6. 7-methylcoumarin; 7. 7-methoxycoumarin; 8. 7-ethoxy-4-methylcoumarin; 9. pyranocoumarin.

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1樣品前處理的選擇

在復(fù)雜基質(zhì)香精成分分析實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)盡量減少前處理步驟,開發(fā)出方便快速的前處理方法。本研究考察了直接提取-低溫離心法和QuEChERS法兩種前處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳的提取凈化效果。在QuEChERS前處理方法中考察了分別加入10 mg C18、10 mg PSA和5 mg PSA+5 mg C18時(shí)9種香精成分的回收率。結(jié)果如表2所示,當(dāng)加入QuEChERS凈化材料后,7-甲氧基香豆素回收率低于50%,香蘭素、香豆素、乙基香蘭素、甲基香蘭素、7-甲基香豆素的回收率均低于80%。而采用直接提取-低溫離心的前處理方式,9種目標(biāo)化合物的回收率均在90%～115%之間,滿足定性定量檢測的要求。因此最終選擇操作簡單、成本低廉的直接提取-低溫離心的前處理凈化方式。

表 2 2種前處理方式下9種香精成分的回收率(n=3)Table 2 Recoveries of the nine flavor components usingthe two pretreatment methods (n=3) %

C18: octadecyl bonded silica; PSA: ethylenediamine-N-propylsilane.

2.3.2提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇在前處理步驟中非常重要,合適的提取溶劑能有效提高提取效率。根據(jù)香豆素和香蘭素類衍生物易溶于極性溶劑的性質(zhì),考察了甲醇、乙醇、乙腈和丙酮4種溶劑的提取效果。結(jié)果如圖3所示,當(dāng)使用丙酮時(shí),其中3種香精成分的回收率在70%以下;當(dāng)使用甲醇時(shí),二氫香豆素的回收率僅為40.1%;使用乙腈時(shí),二氫香豆素的回收率偏高(129.3%),而香蘭素、乙基香蘭素和7-甲氧基香豆素的回收率偏低(均小于80%);但當(dāng)使用乙醇時(shí),9種香精成分的回收率均在90%～120%之間,可滿足檢測要求。故最終選擇乙醇為最佳提取溶劑。

圖 3 提取溶劑對9種香精成分回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recoveries of the nine flavor components (n=3)

2.3.3提取溶劑體積的選擇

提取溶劑體積是影響化合物提取效率的一個(gè)重要因素,提取溶劑用量過少會(huì)造成提取不完全,而用量太多則浪費(fèi)試劑。本研究以乙醇為提取溶劑,以回收率為指標(biāo),考察了不同提取體積(3、5、8、10、15和20 mL)對各目標(biāo)物提取效率的影響。如圖4所示,隨著提取體積的增大,回收率逐漸增加,當(dāng)提取體積大于10 mL時(shí),回收率基本趨于穩(wěn)定,為了確保最佳的提取效率,最終選擇提取溶劑體積為15 mL。

圖 4 提取溶劑體積對9種香精成分回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of extraction solvent volumes on the recoveries of the nine flavor components (n=3)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)(ME)的考察

基質(zhì)效應(yīng)是食品中微/痕量物質(zhì)分析中影響定量結(jié)果的重要因素,因此需要判斷樣品是否有基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過測定基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率大小來考察基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)值根據(jù)公式(1)來計(jì)算:

ME=(1-Ss/Sm)×100%

(1)

其中,Ss是基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,Sm是純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)-50%50%時(shí),說明該化合物的基質(zhì)效應(yīng)明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,除了二氫香豆素、香豆素和甲基香蘭素,其余6種化合物均表現(xiàn)出一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此,為了減小基質(zhì)效應(yīng)對準(zhǔn)確定量的影響,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對化合物定量分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1檢出限、定量限和線性范圍

分別配制一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化好的氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜條件下測定方法的檢出限、定量限和線性范圍。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、各被測組分的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)作圖,繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，9種香精化合物在1～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.997。在空白樣品中分別添加系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行前處理和測定,以3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。如表3所示,各化合物的檢出限和定量限分別為0.002～0.5 μg/kg和0.01～2 μg/kg,表明該方法可以滿足基質(zhì)復(fù)雜物質(zhì)的痕量檢測要求。

表 3 9種香精成分的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the nine flavor compounds

2.5.2回收率和精密度

取空白巴氏殺菌乳樣品1 g,分別添加3個(gè)水平(1倍、2倍和4倍LOQ)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每一水平做6次平行,并計(jì)算平均回收率和日內(nèi)、日間精密度。9種化合物平均回收率為90.3%～110.6%,日內(nèi)精密度為1.6%～7.9%,日間精密度為2.3%～9.3%(見表4)。

表 4 巴氏殺菌乳中9種香精成分的加標(biāo)回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)Table 4 Recoveries, intra-day precisions and inter-day precisions of the nine flavor compounds spiked in pasteurized milk (n=6)

2.5.3實(shí)際樣品檢測

針對市售的巴氏殺菌乳樣品(10個(gè)),用本文建立的方法進(jìn)行了檢測分析。檢測數(shù)據(jù)表明,7-甲氧基香豆素在其中的4個(gè)樣品中檢出,含量范圍為0.01～2 μg/kg,其余8種化合物在實(shí)際樣品中均未檢出。

3 結(jié)論

本研究采用直接提取-低溫高速離心凈化結(jié)合GC-MS/MS,通過優(yōu)選提取溶劑、提取溶劑體積和儀器參數(shù),建立了快速定量測定巴氏殺菌乳中9種香精成分的分析方法。方法學(xué)評(píng)價(jià)和實(shí)際樣品檢測結(jié)果表明,該方法操作簡便,靈敏度高,凈化效果較好,可用于巴氏殺菌乳中多種香精的檢測。