齊一凡 王昊然 萬莉紅

(1. 四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學2015級基地班；2. 華西臨床醫(yī)學院2016級；3. 華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理學教研室，四川 成都 610041)

睡眠缺乏是現(xiàn)代社會中常見的問題，與一系列慢性健康問題相關(guān)，特別是2型糖尿病胰島素抵抗(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)。研究表明，連續(xù)6天每日4小時睡眠，甚至一天睡眠時間不足4小時都會導(dǎo)致胰島素敏感性降低[1,2]。流行病學研究的證據(jù)也支持睡眠不足會誘發(fā)葡萄糖耐受異常和胰島素抵抗[3]。生物鐘節(jié)律失調(diào)和骨骼肌線粒體功能受損可能是睡眠導(dǎo)致胰島素抵抗的原因[4]。運動影響時鐘基因表達，可能會降低睡眠不足帶來的負面影[5]。本實驗擬構(gòu)建睡眠剝奪-胰島素抵抗小鼠模型，探究運動對于睡眠不足引起胰島素抵抗的緩解作用，為睡眠不足引發(fā)的T2DM提供新的干預(yù)思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物

32只3周齡SPF級C57BL/6小鼠，雌雄各半，體重10±2 g，批號：SCXK(渝)2018-0003，購自重慶恩斯維爾科技有限公司。所有小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠8只。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度23±1℃，相對濕度50%±5%，自由飲食水，光暗周期為12/12 h(6∶00am開燈，6∶00pm關(guān)燈)。實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 w。

1.1.2儀器與試劑

實驗室自制改良多平臺睡眠剝奪裝置：標準實驗塑料籠(長37.5 cm×寬32.0 cm×高16.0 cm)，內(nèi)固定14根供小鼠站立的小木塊(長2.0 cm×寬2.0 cm×高5.0 cm)；小鼠血糖測量儀(北京怡成生物電子技術(shù)股份有限公司)；小鼠胰島素試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：E-EL-M2614c)；葡萄糖溶液；嚙齒類動物固定器。

1.2 方法

1.2.1實驗分組

32只小鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)至6周齡，體重15 g～25 g，采用隨機數(shù)字表法隨機分為：對照組、睡眠剝奪組、運動A組、運動B組，每組8只，雌雄各半。除對照組外，其余各組小鼠建立睡眠剝奪模型；運動A，B組小鼠在此基礎(chǔ)上采用不同運動模式進行干預(yù)，具體如下：運動A組小鼠進行不間歇的長時間游泳訓(xùn)練30 min；運動B組小鼠進行間歇游泳訓(xùn)練，每游泳10 min休息10 min，重復(fù)3個循環(huán)，總游泳時長為30 min。

1.2.2睡眠剝奪-胰島素抵抗模型

利用小鼠不能站立入睡的生理特征，采用改良多平臺睡眠剝奪法(Modified multiple platform，MMPM)對小鼠進行睡眠剝奪[6]。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，本次實驗采取睡眠剝奪16 h·d-1，連續(xù)4 d的方案，使小鼠在高存活率下表現(xiàn)出胰島素抵抗。

具體方法：向改良多平臺睡眠剝奪裝置中注入水，水深為4 cm。實驗當天6:00 am將小鼠放入平臺睡眠剝奪裝置，每個裝置8只小鼠，小鼠在裝置中活動不受限制，自由飲食和飲水。16 h后(即10:00 pm)將小鼠從剝奪裝置中取出，用吸水紙輕柔擦干小鼠全身，吹風機吹干后放入鼠籠，給予充足的食物和水，恢復(fù)8 h后進入第二天睡眠剝奪階段，持續(xù)4 d。

1.2.3運動訓(xùn)練

采用水深8 cm睡眠剝奪水箱，使小鼠在25 ℃深水中強迫游泳，強迫游泳實驗一般可被分為4個狀態(tài)，即游泳、攀爬、漂浮、下沉狀態(tài)。為達到實驗?zāi)康模捎幂p柔刺激法使小鼠保持在游泳狀態(tài)。

1.2.4口服葡萄糖耐量試驗(Oral glucose tolerance test，OGTT試驗)

所有小鼠禁食不禁水12 h后立即自尾靜脈取血測量0 min血糖。并灌胃給予小鼠20%葡萄糖溶液2 g·kg-1，在給予葡萄糖后30 min、60 min、90 min、120 min分別測量各時刻血糖值，記錄數(shù)據(jù)，繪制OGTT曲線。

1.2.5胰島素測定

準備質(zhì)量分數(shù)為15%乙二胺四乙酸鈉鹽(EDTA)溶液，按照每毫升血液1.2 mg EDTA，提前加入樣品管中。小鼠禁食不禁水12 h后立即自尾靜脈取血40 μL，1000×g離心15 min，取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血漿胰島素濃度，按照小鼠胰島素試劑盒步驟進行操作。

1.2.6HOMA-IR評估

實驗開始前需要根據(jù)所有小鼠空腹時血糖和胰島素值計算HOMA公式中的校正系數(shù)，根據(jù)實驗前的穩(wěn)態(tài)平均水平計算本次實驗公式為：HOMA-IR=禁食血糖(mmol·L-1)×禁食胰島素(mU·L-1)/0.58。實驗后將每組小鼠OGTT試驗0 min時血樣數(shù)據(jù)帶入公式計算，經(jīng)統(tǒng)計學分析判斷胰島素抵抗是否產(chǎn)生組間差異。

1.2.7統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 OGTT試驗結(jié)果

OGTT試驗糖耐曲線趨勢：運動A組與對照組曲線下降趨勢相似，運動B組有下降趨勢但血糖值高于對照組，睡眠剝奪組短暫下降后進入平臺期；OGTT試驗30 min時血糖：睡眠剝奪組和運動B組小鼠空腹血糖明顯高于對照組(P<0.05)，運動A組與對照組無顯著差異(P>0.05)；OGTT試驗60 min時血糖：睡眠剝奪組和運動B組的血糖明顯高于對照組(P<0.05)，運動A組與對照組無顯著差異(P=0.43)；OGTT試驗90 min時血糖：睡眠剝奪組和運動B組的血糖明顯高于對照組(P<0.05)，運動A組與對照組無顯著差異(P>0.05)；睡眠剝奪組和B運動組出現(xiàn)糖耐量異常，見圖1。

圖1 OGTT糖耐曲線量曲線注：與對照組相比，*P<0.05；與睡眠剝奪組相比，#P<0.05。

2.2 HOMA-IR模型評估結(jié)果

通過將禁食12h后每只小鼠血液樣本中血糖值和胰島素含量帶入公式計算，可得每只小鼠的胰島素抵抗指數(shù)(IR)，通過統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)：睡眠剝奪組的胰島素抵抗組明顯高于對照組(P<0.05)；在睡眠剝奪基礎(chǔ)上進行不間歇長時間游泳訓(xùn)練的運動A組小鼠，胰島素抵抗水平明顯低于睡眠剝奪組(P<0.05)，與對照組相比沒有明顯區(qū)別(P>0.05)；在睡眠剝奪基礎(chǔ)上進行間歇游泳訓(xùn)練的運動B組小鼠，胰島素抵抗水平與睡眠剝奪組相比沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見圖2。

圖2 HOMA-IR評估胰島素抵抗注：與睡眠剝奪組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本次實驗旨在驗證運動能夠緩解小鼠睡眠缺乏導(dǎo)致的胰島素抵抗，實驗要求小鼠睡眠剝奪模型與小鼠運動模型相結(jié)合。由于睡眠缺乏和運動為本實驗的兩個控制變量，為了避免小鼠睡眠剝奪過程中產(chǎn)生大量運動，干擾運動模型，本實驗采用改良多平臺睡眠剝奪法[6]替代常用的旋轉(zhuǎn)圓筒睡眠剝奪法，達到控制變量的目的。

HOMA-IR模型是1985年由Matthews等人提出的一種穩(wěn)態(tài)模型，通過測量禁食后的血糖和胰島素含量評估胰島素抵抗程度。在評估胰島素敏感性的方法中，正常血糖高胰島素鉗夾技術(shù)是測量胰島素抵抗的金標準，但是該技術(shù)需要多次取血，因此應(yīng)用于小鼠實驗不僅對小鼠本身產(chǎn)生較大負擔而且對實驗人員要求較高，并不適用。而采用HOMA-IR模型評估胰島素敏感性，試驗過程中僅需取空腹血液1次，能充分保證小鼠存活，且重復(fù)性高，與正常血糖高胰島素鉗夾技術(shù)相比有很高的相關(guān)性[7,8]，故本實驗采取HOMA-IR模型評估小鼠胰島素水平。人群計算公式為：HOMA-IR=禁食血糖(mmol·L-1)×禁食胰島素(mU·L-1)/22.5，系數(shù)22.5為正常理想人群條件下的校正因子。由于HOMA模型開發(fā)基于正常人群的穩(wěn)態(tài)，不能簡單套用于實驗動物，應(yīng)根據(jù)此次所用實驗動物實驗前的穩(wěn)態(tài)計算公式中的校正系數(shù)。

睡眠缺乏是2型糖尿病胰島素抵抗發(fā)展的重要風險因素，而運動可能會減輕睡眠缺乏的影響。本次實驗證明了長時間不間斷運動可以作為睡眠不足引起的胰島素抵抗和二型糖尿病的早期干預(yù)手段，對于改善胰島素抵抗的效果比同樣時間長度的間斷運動更好。本次實驗中設(shè)計兩種運動，A，B運動的總時間相同，但是B運動相較于A運動存在間隔。對于相同時間的連續(xù)運動和間隔運動之間的區(qū)別已有研究進行探索。12周的每天30min運動訓(xùn)練與3次10min間隔運動訓(xùn)練相比，在最大攝氧量和血膽固醇構(gòu)成上沒有明顯區(qū)別[9]。另一項對于小鼠的研究表明，30min的連續(xù)運動訓(xùn)練和10min的3次間隔訓(xùn)練在改變線粒體代謝的信號通路上沒有發(fā)現(xiàn)明顯的不同，通過對于線粒體代謝p38 MAPK通路的研究表明兩種運動都可以提高線粒體代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。運動緩解睡眠缺乏導(dǎo)致胰島素抵抗可能是通過改善生物節(jié)律和線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實現(xiàn)的，對于連續(xù)運動和間隔運動影響睡眠缺乏后的生物節(jié)律和線粒體轉(zhuǎn)導(dǎo)還沒有相關(guān)研究，其具體機制以及不同運動模式間存在的區(qū)別將在后續(xù)實驗中進行探索。