李洪貞 夏艷 單佳妮 季杰

(1. 北京昭衍新藥研究中心股份有限公司，生物制品安全性評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176；2. 昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，江蘇 蘇州 215421)

糖尿病是由多種病因所致的以慢性高血糖為特征的一類代謝性疾病，多因胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗所致。隨著生活生平的不斷提高，肥胖率增加，糖尿病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率持續(xù)增高[1,2]，且發(fā)病年齡有降低趨勢(shì)。其中2型糖尿病占糖尿病患病人數(shù)的90%以上，盡管患者體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并非完全喪失，有的患者體內(nèi)胰島素甚至產(chǎn)生過多，但胰島素的作用效果較差，因此患者體內(nèi)的胰島素處于相對(duì)缺乏狀態(tài)。

胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由腸道分泌的一種腸促胰素[3]，具有葡萄糖依賴性促進(jìn)胰島素分泌的能力，可通過多種機(jī)制有效降低2型糖尿病患者的血糖水平，同時(shí)亦可減輕患者體重、改善α和β細(xì)胞功能。GLP-1受體激動(dòng)劑可通過與GLP-1受體結(jié)合，產(chǎn)生GLP-1受體激動(dòng)后效應(yīng)，與傳統(tǒng)口服降糖藥物相比，作用更為全面[4]。

艾塞那肽(Byetta，百泌達(dá))是最早上市的GLP-1受體激動(dòng)劑，于2009年經(jīng)中國(guó)CFDA批準(zhǔn)上市。該藥適用于二甲雙胍基礎(chǔ)上加用磺脲類和(或)噻唑烷二酮類藥物控制血糖仍不滿意的2型糖尿病患者，于每日早餐和晚餐前60 min內(nèi)皮下注射。由于其半衰期短，需要每日2次注射。2012年1月，美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了艾塞那肽注射液每周一次緩釋劑型的上市申請(qǐng)，這是2型糖尿病治療中首個(gè)每周使用一次的治療藥物，給藥時(shí)間的延長(zhǎng)使得患者用藥更為方便，大大提高了患者的依從性[5]。

艾塞那肽緩釋制劑是將艾塞那肽分子分散到微球當(dāng)中，通過皮下注射的方式進(jìn)入體內(nèi)后，微球粒子通過自發(fā)的水解作用，將有效成分緩慢吸收到體內(nèi)循環(huán)當(dāng)中。這一特點(diǎn)更有利藥物濃度長(zhǎng)時(shí)間維持在有效的血藥濃度之上，更好的發(fā)揮藥理作用[6,7]。本實(shí)驗(yàn)擬考察注射用艾塞那肽微球單次皮下注射給予食蟹猴的免疫原性及藥代特征，并與已上市藥物Bydureon比較，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

受試物：注射用艾塞那肽微球，某藥廠提供，批號(hào)130205，白色至類白色粉末，2mg/支，2-8℃保存，有效期暫定至2014年2月。

市售品：注射用艾塞那肽微球(Bydureon)，Amylin生產(chǎn)，批號(hào)73177，白色至類白色粉末，2 mg/支，2-8℃保存，有效期至2014年4月。

1.2 主要試劑及試劑盒

艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品：由某藥廠提供，批號(hào)121204，白色至類白色粉末，50 mg/支，艾塞那肽含量99.2%，-20℃以下保存，有效期暫定至2014年12月；Exendin-4檢測(cè)試劑盒(FEK-070-94)購(gòu)于Phoenix Pharmaceuticals(美國(guó))；抑肽酶(11583794001)購(gòu)于Roche(美國(guó))；HRP標(biāo)記兔抗猴IgG抗體(A2054)購(gòu)于Sigma(美國(guó))；牛白蛋白(69003433)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TMB顯色底物(C09-555214)購(gòu)于BD(美國(guó))。

1.3 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)(5810R)由Eppendorf生產(chǎn)，多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max M5)由Molecular Device生產(chǎn)，洗板機(jī)(ELx405 Select CW)由Biotek生產(chǎn)。

1.4 動(dòng)物

普通級(jí)食蟹猴(購(gòu)于廣西南寧市富澤野生動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司)16只，雌雄各半，體重范圍2.89～3.67 kg。動(dòng)物群養(yǎng)于普通級(jí)動(dòng)物房的不銹鋼籠內(nèi)，每籠每性別不超過4只。每日上午和下午各喂食一次猴飼料，平均每只動(dòng)物每次喂飼料約100 g左右，并輔喂水果或蔬菜50 g左右；動(dòng)物自由飲水，飲用符合國(guó)家城市生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的自來水。

本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物使用方法經(jīng)昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司動(dòng)物管理與使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。IACUC批準(zhǔn)編號(hào)為：ACU18-304。

1.5 方法

所有動(dòng)物按性別隨機(jī)分成受試物組和市售品組，每組雌雄各4只。每瓶受試物/市售品凍干粉加入一瓶注射用艾塞那肽微球?qū)Ｓ萌軇┗靹?，艾塞那肽濃?.08 mg·mL-1，分別皮下注射給予動(dòng)物0.14 mL·kg-1，給藥劑量0.44 mg·kg-1。

所有動(dòng)物于給藥前、給藥后2、4、6、8、10 w，上肢或下肢靜脈采集全血約1.0 mL。分離血漿，采用ELISA法檢測(cè)特異性抗艾塞那肽IgG抗體，檢測(cè)方法：艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品用碳酸鹽緩沖液稀釋至1 μg·mL-1包被至微孔板上，3%的BSA封閉后加入5倍梯度稀釋的血漿樣本，洗板后加入HRP標(biāo)記兔抗猴IgG，加入TMB顯色底物，加入H2SO4終止后在450 nm處測(cè)定吸光度，以藥前值為對(duì)照，高于藥前值的1.5倍為抗體陽性。

各動(dòng)物于給藥前(0 h)、給藥后0.5、1、3、6、12 h，1、2、3、5、7、10、14、17、21、24、28、31、35、38、42、45、49、52、56、63、70 d上或下肢靜脈采集全血約0.5 mL，放入預(yù)加5 μL肝素鈉(6250 IU·mL-1)和6 μL抑肽酶(50 TIU·mL-1)的離心管中(取血前，含有肝素鈉和抑肽酶的離心管于2～8℃或冰浴保存)，混勻分離血漿，離心條件為：1000 g，4℃，10 min，采用商品化的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒測(cè)定血漿中艾塞那肽濃度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用WinNonlin(V6.2)軟件的非房室模型法(NCA)對(duì)代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，主要包括AUC、Cmax、Tmax等參數(shù)。利用Microsoft Office Excel計(jì)算均值，標(biāo)準(zhǔn)差，變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 抗艾塞那肽抗體

抗艾塞那肽抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥后2 w，受試物組一只雄性動(dòng)物產(chǎn)生抗藥抗體(滴度1:25)，給藥后4 w受試物、市售品分別有4只、3只動(dòng)物檢出抗藥抗體，至給藥后70 d(10 w)兩組各有7只動(dòng)物檢出抗藥抗體，其中兩組動(dòng)物分別有1只、2只動(dòng)物抗體滴度超過1:125，其他抗體陽性動(dòng)物的滴度介于1:5-1:125。表明單次皮下注射給予食蟹猴，受試物與市售品有相似的免疫原性，見表1。

2.2 血漿艾塞那肽濃度

給藥后受試物組及市售品組各動(dòng)物平均血漿藥物-時(shí)間變化見圖1、圖2。

結(jié)果顯示，受試物皮下注射給予食蟹猴后，在給藥后的前6 h有一個(gè)初始釋放，此后藥物低濃度釋放，藥物的主要釋放在給藥后約10 d開始，并在第28 d左右達(dá)峰，持續(xù)至約42 d，至給藥后70 d，仍有5只動(dòng)物血漿中可以檢測(cè)到藥物的存在。

市售品皮下注射給予食蟹猴后，在給藥后的前6個(gè)小時(shí)有一個(gè)初始釋放，此后藥物低濃度釋放，藥物的主要釋放在給藥后約10 d開始，并在第28 d左右達(dá)峰，持續(xù)至約45 d，至給藥后70 d，仍有7只動(dòng)物血漿中可以檢測(cè)到藥物的存在。

表1 給藥后各動(dòng)物抗艾塞那肽抗體產(chǎn)生情況

備注：“-”表示抗體測(cè)定結(jié)果陰性。

圖1 給藥后受試物組動(dòng)物血漿藥物濃度-時(shí)間變化

圖2 給藥后市售品組動(dòng)物血漿藥物濃度-時(shí)間變化

結(jié)合各動(dòng)物抗體的產(chǎn)生情況，除受微球中艾塞那肽的釋放外，血漿藥物濃度及系統(tǒng)暴露量與抗艾塞那肽抗體的水平相關(guān)，較高滴度的抗體延緩藥物的清除。給藥后4 w供試品組12號(hào)動(dòng)物抗藥抗體滴度為1:625，給藥后6 w升至1:3125。給藥后6w，對(duì)照品組15號(hào)動(dòng)物抗體滴度1:625，給藥后8 w，13號(hào)動(dòng)物抗體滴度為1:625，以上三只動(dòng)物血藥濃度均受到明顯影響，高于同時(shí)間點(diǎn)其他動(dòng)物；其余各組動(dòng)物抗藥抗體滴度均≤1:125，除對(duì)照組14號(hào)動(dòng)物外，均對(duì)血藥濃度影響不明顯，所以采用抗藥抗體滴度≤1:125為劃分標(biāo)準(zhǔn)(不包括14號(hào)動(dòng)物)，進(jìn)行比較分析，結(jié)果見圖3。

結(jié)果顯示，受試物及市售品單次皮下注射給予食蟹猴后，兩組動(dòng)物血漿藥物濃度相當(dāng)，且隨時(shí)間變化趨勢(shì)一致。

圖3 給藥后各組動(dòng)物平均血漿藥物濃度-時(shí)間變化注：所有動(dòng)物n=8；受試物組部分動(dòng)物n=7；市售品組部分動(dòng)物n=5。

2.3 代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

給藥后受試物、市售品組各動(dòng)物體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2、表3。

結(jié)果表明，受試物、市售品單次皮下注射給予食蟹猴(0.44 mg·kg-1)后各組雌雄動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)無顯著差異(P>0.05)，受試物與市售品間各藥代參數(shù)無顯著差異(P>0.05)，微球藥物釋放及藥代特征均一致。

2 討論

艾塞那肽是胰高血糖樣肽-1(GLP-1)的類似物，具有與GLP-1幾乎相同的生物學(xué)活性，但穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于GLP-1。艾塞那肽不僅能夠促進(jìn)胰島素合成和分泌，還能促進(jìn)胰島細(xì)胞中胰島素基因轉(zhuǎn)錄以及增加靶組織對(duì)胰島素敏感性，但其促胰島素分泌作用依賴于高血糖濃度，血糖濃度較低時(shí)就不會(huì)增加胰島素分泌，從而避免低血糖發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)選用正常動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，動(dòng)物血糖水平較低，不足以使艾塞那肽促進(jìn)胰島素的分泌，因此本實(shí)驗(yàn)未觀察動(dòng)物血糖水平變化。

表2 受試物單次皮下注射給予食蟹猴后藥代參數(shù)計(jì)算

注：Cmax,p表示給藥后至24 h血漿藥物峰濃度，Cmax,t表示至給藥后70天血漿藥物峰濃度；p表示不同性別間比較，p′表示與市售品組比較(所有動(dòng)物)，student t test；“總體”表示包含該組所有動(dòng)物，“部分”表示不包含12號(hào)動(dòng)物。

表3 市售品單次皮下注射給予食蟹猴后藥代參數(shù)計(jì)算

注：Cmax,p表示給藥后至24 h血漿藥物峰濃度，Cmax,t表示至給藥后70天血漿藥物峰濃度；p表示不同性別間比較，student t test；“總體”表示包含該組所有動(dòng)物，“部分”表示不包含13、14、15號(hào)動(dòng)物。

對(duì)照品的臨床前研究資料[8]表明，單次皮下注射給藥后兩周，食蟹猴產(chǎn)生抗藥抗體，抗體不具有中和性，當(dāng)抗體滴度高于1:125時(shí)，艾塞那肽的體內(nèi)消除減慢，血漿暴露量增加，抗體滴度低于1:125時(shí)，除個(gè)別動(dòng)物外，艾塞那肽的暴露量變化不明顯。

本實(shí)驗(yàn)中，供試品和對(duì)照品組動(dòng)物從給藥后2 w開始出現(xiàn)抗藥抗體，給藥后4w供試品組12號(hào)動(dòng)物抗藥抗體滴度為1:625，給藥后6w升至1:3125；給藥后6w，對(duì)照品組15號(hào)動(dòng)物抗體滴度1:625，給藥后8w，13號(hào)動(dòng)物抗體滴度為1:625，以上三只動(dòng)物血藥濃度均受到明顯影響，其余各組動(dòng)物抗藥抗體滴度均≤1:125，除對(duì)照組14號(hào)動(dòng)物外，均對(duì)血藥濃度影響不明顯，本試驗(yàn)采用抗藥抗體滴度≤1:125為劃分標(biāo)準(zhǔn)(不包括14號(hào)動(dòng)物)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

試驗(yàn)中，供試品組和市售對(duì)照品Bydureon在血藥濃度變化趨勢(shì)、AUC、Cmax及Tmax等方面均無顯著差異。但是，本試驗(yàn)中動(dòng)物暴露量(AUC、Cmax)相關(guān)參數(shù)與Bydureon在FDA綜述資料中公布的同等劑量對(duì)應(yīng)參數(shù)有一定差異。由于本品血藥濃度受抗體滴度影響明顯，Bydureon藥代試驗(yàn)使用動(dòng)物較少，且個(gè)體差異大，抗體滴度范圍為1:5-1:3125，故而推測(cè)不同試驗(yàn)之間的差異可能與本品的免疫原性相關(guān)。

另外，Bydureon和Byetta(百泌達(dá))臨床研究中均發(fā)現(xiàn)抗艾塞那肽抗體的產(chǎn)生對(duì)血漿中艾塞那肽暴露量有一定影響，且不同的抗體滴度對(duì)艾塞那肽暴露量的影響不同。本試驗(yàn)中供試品和Bydureon對(duì)照品給予食蟹猴后也發(fā)現(xiàn)了抗藥抗體存在，提示臨床研究中應(yīng)關(guān)注本產(chǎn)品的免疫原性指標(biāo)。