楊孝勤 李正強 陳軍 方煒 馬偉群 萬荻 鄭俊發(fā)

(南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院，廣東 廣州 510280)

被稱為“內(nèi)源性骨組織工程”的牽張成骨避免了自體骨組織移植需開辟第二術區(qū)和人工材料植入的免疫排斥反應及強度不夠等缺點，同時實現(xiàn)周圍軟組織的同步擴展等優(yōu)勢，目前已經(jīng)成為一種治療正頜外科、頜骨重建、口腔種植治療頜骨畸形和頜骨缺損的重要方法[1]。然而，牽張成骨作為一種新技術，在許多方面還需深入研究，主要有牽張成骨仍存在固定期過長、新骨形成不良等弊端，如何縮短治療時間，減少并發(fā)癥，提高再生骨質(zhì)量成為當前牽張成骨需要解決的最大難題。目前眾多學者采取了多種輔助方法[2,3]，盡管部分方法獲得了一定的效果，然而均未能獲得廣泛的臨床運用，存在各種各樣的問題，如：技術復雜、費用高、周期長、生物學不安全等缺點。因此，尋找一種簡單、廉價、安全的方法來促進骨組織再生仍是目前牽張成骨研究領域關注的一個熱點。

辛伐他汀則是臨床上最常用的他汀類藥物，羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，有很好的降高血脂、高膽固醇作用，已在臨床上應用20多年，具有高度的生物安全性。近年來研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能通過誘導骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogeneticprotein，BMP)促進成骨，已被應用于修復骨折和骨缺損取得了較好的效果。因此，本研究擬利用本課題組建立的多單元細胞拉伸裝置評估辛伐他汀能否協(xié)同單軸靜態(tài)牽張力促進成骨細胞的成骨基因表達，為后期動物實驗提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器

多單元細胞拉伸裝置由四川大學與電子科技大學聯(lián)合研制，新生SD大鼠由四川大學華西實驗動物中心提供，性別不限，細胞培養(yǎng)相關試劑與材料購自美國Gibco公司，實時定量RT-PCR試劑購于Takara公司，Ⅰ型鼠尾膠原蛋白、辛伐他汀購于美國Sigma公司。

1.2 多單元細胞拉伸裝置

多單元細胞拉伸裝置是本課題組與電子科技大學聯(lián)合研制。多單元細胞拉伸裝置，由控制單元、顯示單元、按鍵單元、驅(qū)動單元、動力加載單元、細胞培養(yǎng)單元、向控制單元和驅(qū)動單元提供工作電流的電源組成，見圖1。根據(jù)本課題組以前研究提示10%單軸靜態(tài)牽張力促進成骨細胞的成骨基因表達最強[4]。因此，本研究選擇用10%單軸靜態(tài)牽張力。

圖1 多單元細胞拉伸裝置

1.3 成骨細胞的體外培養(yǎng)與鑒定

本實驗采用兩步酶消化法原代培養(yǎng)成骨細胞[5]。簡言之，將新生1-2 d SD大鼠的顱蓋骨剪碎成約0.5 mm2大小的骨碎片。加入質(zhì)量濃度0.25%胰蛋白酶1 mL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)預消化后棄除消化上清液，再加入1 mg·mL-1Ⅱ型膠原酶溶液1 mL，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化30 min，收集消化上清液1000×g離心5 min，將收集到的細胞混勻后，按細胞數(shù)2×105個細胞/瓶接種于25 mL培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，待細胞覆蓋程度達到培養(yǎng)瓶底面積的80%時，按1∶3的比例進行傳代培養(yǎng)，將3-6代細胞用于后續(xù)實驗。通過細胞形態(tài)觀察、堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學法、四環(huán)素和茜素紅染色礦化結節(jié)法鑒定培養(yǎng)細胞為成骨細胞。

1.4 實驗分組與方法

將第3-6代的2 mL含2×104個·mL-1成骨細胞懸液接種至細胞培養(yǎng)單元內(nèi)包被了Ⅰ型鼠尾膠原蛋白的硅膠膜上的硅膠膜矩形環(huán)內(nèi)。37oC，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后細胞已完全貼壁于硅膠膜上，取出硅膠膜矩形環(huán)，補加10 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后對成骨細胞施加10%的單軸靜態(tài)牽張力或培養(yǎng)在含10-7mol·L-1辛伐他汀的培養(yǎng)液中。實驗分為4組，分別為Stretch組、Sim組、Stretch+辛伐他汀組和Ctrl組。其中Stretch組為10%單軸靜態(tài)牽張力，Sim組為10-7mol·L-1辛伐他汀，Stretch+Sim組為10%單軸靜態(tài)牽張力合并10-7mol·L-1辛伐他汀，Ctrl組為未處理的對照組。加力3 d后收集細胞，每組實驗重復3次。

1.5 實時定量PCR檢測runx 2、alp基因表達

按照HiFi-MMLV cDNA 第1鏈合成試劑盒和UltraSYBR Mixture說明書進行操作。runx2(NM_053470.2)上游引物：5’-cttcgtcagcgtcctatcagttc-3’，下游引物：5’-cagcgtcaacaccatcattctg-3’；alp(NM_013059.1)上游引物：5’-gaccctgccttaccaactcatt-3’，下游引物：5’-gtggagacgcccataccatct-3’；GAPDH(XR_009170.1)上游引物：5’-tatgactctacccacggcaagt-3’，下游引物：5’-atactcagcaccagcatcacc-3’。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按以下條件擴增：95℃預變性8 min；95℃變性15 s、60℃退火、延伸1 min，35個循環(huán)。溶解曲線分析為95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用2-△△Ct法分析目的基因相對表達量。實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 新生SD大鼠顱骨成骨細胞的體外培養(yǎng)與鑒定結果

如圖2a所示，新生SD大鼠顱骨原代培養(yǎng)的成骨細胞多呈梭形、三角形或星形的不規(guī)則形態(tài)，細胞形態(tài)飽滿，邊界清晰，表面較光滑。成骨細胞傳代培養(yǎng)后逐漸伸展變形，胞體逐漸展開成短梭形，繼而變成星形或多極形(圖2b)。圖2c示alp染色實驗，成骨細胞染色后核呈紫色，胞漿出現(xiàn)中等量的紅棕色顆粒，有些為咖啡色或棕褐色顆粒。圖2d顯示了Ⅰ型膠原表達的免疫組織化學染色，可見細胞呈Ⅰ型膠原強陽性。圖2e示成骨細胞鈣化結節(jié)四環(huán)素染色，熒光顯微鏡觀察可見鈣化結節(jié)呈明亮的黃色熒光。圖2f顯示鈣化結節(jié)茜素紅染色，成骨細胞是非接觸抑制性生長，4-5周時細胞匯合呈復層生長，局部堆積形成灶狀白色鈣化結節(jié)，用茜素紅染色鮮紅者表明為鈣化組織。

圖2 新生SD大鼠顱骨成骨細胞的體外培養(yǎng)與鑒定結果注：a，原代成骨細胞倒置相差顯微鏡下觀×10；b，傳代成骨細胞倒置相差顯微鏡下觀×100；c，成骨細胞堿性磷酸酶染色普通顯微鏡下觀×100；d，成骨細胞Ⅰ型膠原表達的免疫組織化學染色普通顯微鏡下觀×100；e，成骨細胞鈣化結節(jié)四環(huán)素染色熒光顯微鏡下觀×40；f，成骨細胞鈣化結節(jié)茜素紅染色普通顯微鏡下觀×40。

2.2 辛伐他汀增強單軸靜態(tài)牽張力誘導的成骨細胞的runx 2、alp mRNA的表達

通過實時熒光定量RT-PCR檢測成骨細胞runx2、alpmRNA的表達，結果如圖3a，b所示，相對對照組，10%單軸靜態(tài)牽張力、10-7mol·L-1辛伐他汀能分別誘導成骨細胞runx2、alpmRNA的表達增加(P<0.05)。進一步結果發(fā)現(xiàn)10-7mol·L-1辛伐他汀與10%單軸靜態(tài)牽張力共同作用下成骨細胞runx2、alpmRNA的表達要比單獨10-7mol·L-1辛伐他汀或10%單軸靜態(tài)牽張力顯著提高(P<0.05)，見圖3a，b。

圖3 成骨細胞runx2、alp mRNA的表達水平注：*P<0.05。

3 討論

牽張成骨是通過切開骨皮質(zhì)后一周逐漸牽拉骨痂以延長骨的方法，是利用骨組織細胞在受到張應力刺激時活化、增殖，原位再生一段新骨的生物原理發(fā)展起來的一種新的骨發(fā)育不足與缺損修復方法，在口腔頜面整復外科領域有著廣泛的應用前景[1]。然而，牽張成骨作為一種新技術，在許多方面還需深入研究，主要有牽張成骨骨再生過程涉及的細胞和信號分子網(wǎng)絡復雜，其在細胞和分子水平上的生物學機制尚未闡明。其次，牽張成骨仍存在固定期過長、新骨形成不良等弊端，限制了該技術在臨床上的應用和推廣。因此，探索牽張成骨骨再生的細胞和分子機制，尋求有效措施促進牽張成骨骨再生，縮短治療周期，減少骨形成不良等并發(fā)癥，是國內(nèi)外學者探索的一個重要前沿課題。本研究利用已建立的多單元細胞拉伸裝置對成骨細胞施加10%單軸靜態(tài)牽張力，結果發(fā)現(xiàn)10%單軸靜態(tài)牽張力促進了成骨細胞的成骨相關基因runx2和alpmRNA表達。這與Yang等[6]研究結果一致，他們通過Flexcell加力系統(tǒng)對成骨樣細胞施加最大幅度為10%的周期性間斷性張應力，表明周期性間斷性張應力增強了人牙周膜細胞的runx2、alpmRNA的表達。由于在牽張成骨過程中細胞所受的牽張力應是單軸靜態(tài)持續(xù)的，因此本課題使用單軸靜態(tài)牽張力可能更能模擬成骨細胞在牽張成骨過程中所受的力學刺激。

Mundy等通過動物實驗對3萬多種天然化合物進行篩選發(fā)現(xiàn)他汀類藥物(尤其是辛伐他汀和洛伐他汀)是唯一具有促進骨形成代謝作用的天然藥物，可以增強BMP-2啟動子活性，促進堿性磷酸酶活性升高和礦化結節(jié)形成，促進骨形成[7]。他汀類藥物由小而穩(wěn)定的分子組成，不易被蛋白水解，易于合成，而且價格便宜。研究證明，辛伐他汀具有良好的促成骨作用，不但可以改善全身的骨代謝狀態(tài)，而且可以增強局部骨修復效能，同時可以抑制破骨細胞的骨吸收相關途徑，進一步促進成骨作用[8]。本研究結果發(fā)現(xiàn)10-7mol·L-1辛伐他汀能增加成骨細胞的成骨相關基因runx2和alpmRNA表達。

目前眾多學者采取了多種輔助方法如物理方法(電刺激、電磁刺激、機械刺激、高壓氧、低強度脈沖超聲刺激等)、生長因子和激素(骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、生長激素、降血鈣素等)、細胞移植(自體骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞等)、組織工程法(自體骨髓間充質(zhì)干細胞復合血小板豐富的血漿和人凝血酶凝膠)、藥物(二膦酸鹽、硫酸鈣等)[3,9,10]。盡管部分方法獲得了一定的效果，然而均未能獲得廣泛的臨床運用，存在各種各樣的問題，如：技術復雜、費用高、周期長、生物學不安全等缺點。因此，尋找一種簡單、廉價、安全的方法來促進骨組織再生仍是目前牽張成骨研究領域關注的一個熱點。辛伐他汀具有良好的促成骨作用，同時具有生物安全性高、易于合成和價格便宜的優(yōu)點。本課題組對培養(yǎng)在含10-7mol·L-1辛伐他汀的培養(yǎng)液的成骨細胞施加將10%單軸靜態(tài)牽張力，結果表明辛伐他汀能協(xié)同10%單軸靜態(tài)細胞牽張力上調(diào)成骨細胞的成骨基因runx2、alpmRNA的表達，為后續(xù)的辛伐他汀促進頜骨牽張成骨的動物實驗提供基礎。