干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮提取物總?cè)坪考捌錃⒙莼钚缘挠绊?/h1>
2019-10-11 05:46:18李晶晶甘金佳
天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2019年9期
李晶晶，甘金佳，莫 玲，程 浩
1桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，桂林 541004； 2中國科學(xué)院廣西植物研究所，桂林 541006
福壽螺Pomaceacanaliculata，原產(chǎn)于南美洲，是一種嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類健康的世界性惡性外來入侵物種，也是我國環(huán)保部公布的首批入侵我國的16種“危害最大的外來物種”之一。在我國，受到福壽螺入侵災(zāi)害影響的包括我國長(zhǎng)江以南的十幾個(gè)省區(qū)，給當(dāng)?shù)氐乃竞退魑锓N植造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)災(zāi)害[1,2]；同時(shí)，福壽螺還是能引起人類嗜酸性腦膜炎的廣州管圓線蟲的中間宿主，危害人類健康[3]。目前化學(xué)藥劑滅螺是最主要的控制福壽螺措施，但目前登記的殺螺藥劑極少(僅有殺螺胺類和四聚乙醛兩種)，且存在毒性大、污染環(huán)境、抗藥性以及價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)[4,5]，使福壽螺防治始終是困擾人們的巨大難題。因此，尋找對(duì)環(huán)境安全、高效、低毒的天然源殺螺藥劑勢(shì)在必行。
桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物，是世界上種植面積最廣的樹種之一。桉樹皮中含有單寧[6]、三萜[7-9]、間苯三酚、黃酮類、單萜、酚酸、甾醇等化學(xué)成分[10-12]，是一種可以重復(fù)利用的生物資源。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)桉樹皮提取物對(duì)福壽螺具有很強(qiáng)的毒殺活性，其主要的活性成分為五環(huán)三萜類化合物[8,9]，可能是一種有開發(fā)潛力的植物源殺螺藥劑，值得進(jìn)一步研究其作用機(jī)理。桉樹皮作為桉樹木材加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，資源非常巨大。桉樹在我國的種植面積已達(dá)450 hm2，年產(chǎn)木材超過3 000萬m3[13]，根據(jù)桉樹皮產(chǎn)量為原木產(chǎn)量的11%計(jì)算[14]，年產(chǎn)桉樹皮約330萬m3。目前，我國絕大部分桉樹皮通常被直接丟棄，其中的活性物質(zhì)沒有得到充分利用造成了巨大的浪費(fèi)。
目前對(duì)于桉樹皮的研究主要集中在其化學(xué)成分及抗氧化、抑菌活性方面，在農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用僅有我們研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了少量研究，總體來說，桉樹皮資源尚未得到充分利用。廣西是我國桉樹種植面積最大的省，尾巨桉(Eucalyptusurophylla×Eucalyptusgrandis)是廣西目前主要種植的桉樹樹種，目前有關(guān)尾巨桉樹皮對(duì)福壽螺的毒殺活性及作用機(jī)理的研究尚未見報(bào)道。本研究主要考察不同干燥方式和乙醇提取濃度對(duì)桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪亢蜌⒙莼钚缘挠绊?，并測(cè)定經(jīng)桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足部、肝臟中蛋白質(zhì)含量及酶活性的變化，初步探討其殺螺作用機(jī)理，以期為桉樹皮在農(nóng)藥領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
新鮮剝落尾巨桉E.urophylla×E.grandis樹皮采自廣西柳州鹿寨縣黃冕林場(chǎng)，由廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所姚月鋒副研究員鑒定。
1.1.2 供試軟體動(dòng)物
福壽螺Pomaceacanaliculata幼螺采自桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)場(chǎng)水稻田溝邊，于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7天后，選用大小一致、無損傷的幼螺供室內(nèi)試驗(yàn)。
1.1.3 主要儀器和試劑
FE-130植物粉碎機(jī)(河北黃曄科學(xué)儀器廠)，EYELA-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Tokyo Rikakikai公司)，101A-1E型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，F(xiàn)E-1CE型多歧管冷凍干燥機(jī)(博醫(yī)康科技公司)，LUX型多功能性酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)，Biomate3S型紫外可見光分光光度儀 (美國Thermo Fisher Scientific 公司)。茶皂素原粉：中國農(nóng)科院茶葉研究所提供，含量60%?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、LDH(乳酸脫氫酶)試劑盒、 AKP(堿性磷酸酶)試劑盒、ALT/GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒、AST/GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒：南京建成生物工程中心；其余試劑為國產(chǎn)分析純。
1.2 方法
1.2.1 尾巨桉樹皮乙醇提取物的制備
取新鮮剝落的尾巨桉樹皮，置于通風(fēng)陰涼處陰干至水分含量為9%，粉碎后過60目篩。分別稱取200.0 g尾巨桉樹皮粉末，按料液比為1 g∶40 mL的比例，分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、60%、80%、90%的乙醇水溶液，超聲波提取2 h(功率500 w，溫度60 ℃)，經(jīng)布氏漏斗抽濾后收集濾液。上述過程重復(fù)2次，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上述濾液減壓濃縮得到樹皮乙醇提取物浸膏，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 尾巨桉樹皮乙醇提取物的干燥處理
稱取在4 ℃冰箱中保存的尾巨桉樹皮乙醇提取物浸膏，分別置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱及冷凍干燥機(jī)中干燥至恒重。鼓風(fēng)干燥條件為40 ℃，干燥24 h。冷凍干燥條件為，先在-20 ℃冰箱中預(yù)凍24 h，冷阱溫度-40 ℃，真空度0.025 MPa，干燥時(shí)間約48 h。兩種不同干燥方式干燥后的樹皮乙醇提取物研磨成粉末后過篩(100目)，分別放入密封袋內(nèi)保存，用于活性成分和生物活性測(cè)定。
1.2.3 尾巨桉樹皮提取物的總?cè)坪繙y(cè)定
分別吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL(相當(dāng)于熊果酸0～58.5 μg)置于10 mL比色管中， 60 ℃水浴蒸干后加入0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸，混勻，然后加1 mL高氯酸，混勻，在60 ℃水浴中加熱15 min后移入冰浴中冷卻，加入5 mL冰醋酸，充分混勻，于548 nm處測(cè)定并記錄吸光度值，以熊果酸質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
準(zhǔn)確稱取0.05 g樹皮乙醇提取物粉末，用30 mL氯仿轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，超聲波提取30 min，取出冷卻至室溫，用氯仿加至刻度，搖勻，取上清液0.5 mL置于10 mL比色管中，在60 ℃水浴蒸干，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作操作步驟，在548 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度[15]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式計(jì)算樣品液三萜含量。
W%=[(C×V1)/(m×V2)]×100 (1)
式中：W-樣品中三萜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)； C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得樣品測(cè)定液中總?cè)频暮?μg)；V1-樣品測(cè)定液總體積(mL)；m-尾巨桉樹皮乙醇提取物的質(zhì)量(g)；V2-測(cè)定時(shí)所取的樣品測(cè)定液體積(mL)。
1.2.4 福壽螺室內(nèi)毒殺活性測(cè)定
采用藥劑浸泡法進(jìn)行殺螺活性試驗(yàn)[16]。稱取一定量的待測(cè)樣品，用甲醇溶解，然后用去氯水配制成50 mg/L的溶液(甲醇含量不超過2%)，以相同含量的甲醇去氯水做空白對(duì)照。用燒杯盛放200 mL藥液，每杯放入20頭幼螺，放入生菜，杯口用紗布封口以防其逃逸。實(shí)驗(yàn)開始后，連續(xù)觀察和記錄2、6、24 h福壽螺的離水上爬情況，分別于處理24、48、72 h觀察和記錄福壽螺的死亡情況，計(jì)算福壽螺的上爬率和校正死亡率。
1.2.5 福壽螺頭足和肝臟中蛋白質(zhì)含量和酶活性測(cè)定
用50 mg/L的尾巨桉樹皮提取物浸泡福壽螺，另設(shè)去氯水為空白對(duì)照。分別于40 h隨機(jī)取5只活福壽螺，用去氯水洗凈，去殼取出福壽螺的頭足和肝臟部分，用吸水紙吸干福壽螺表面的水分，于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。分別稱取1 g福壽螺頭足部和肝臟組織，按福壽螺組織重量1∶5的比例，加入0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液，用微量電動(dòng)勻漿器于4 ℃勻漿，將待測(cè)組織勻漿離心分離(4 ℃，3 500 rpm，15 min)，然后取上清液采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定福壽螺頭足和肝臟中蛋白質(zhì)含量，參照試劑盒說明書分別測(cè)定福壽螺頭足和肝臟中的LDH、AKP、ALT/GPT和AST/GOT酶活性。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析
每個(gè)樣品設(shè)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用Excel 2010和SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)間差異分析。測(cè)定結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.05為差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物中三萜類物質(zhì)含量的影響
以不同體積分?jǐn)?shù)(40%、60%、80%和90%)的乙醇溶液作為提取溶劑提取尾巨桉樹皮，分別采用鼓風(fēng)干燥和冷凍干燥兩種方式干燥提取液浸膏，測(cè)定各組提取液中總?cè)频暮?。由圖1可知，不同體積分?jǐn)?shù)的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)频暮烤尸F(xiàn)顯著性差異。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)到達(dá)60%時(shí)，尾巨桉樹皮提取物中總?cè)坪孔罡撸娘L(fēng)干燥和冷凍干燥的樹皮提取物中總?cè)坪糠謩e達(dá)到10.81%和13.90%。因此，本實(shí)驗(yàn)選取60%乙醇溶液作為尾巨桉樹皮的提取溶劑。在提取條件相同的情況下，冷凍干燥的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪慷济黠@高于鼓風(fēng)干燥的樹皮乙醇提取物(P<0.05)，表明冷凍干燥過程中活性成分損失少，能更好保持尾巨桉樹皮提取物中的三萜類活性物質(zhì)。
圖1 不同干燥方式的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪縁ig.1 Total triterpenoids content of E.urophylla×E.grandis bark extracts drying by different methods 注：圖中小寫字母不同時(shí)，表示差異顯著(P <0.05)。Note:The data in the same column followed by different letters are significant different among treatments (P <0.05).
2.2 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物抑制福壽螺離水上爬的影響
尾巨桉樹皮提取物抑制福壽螺離水上爬的效果見表1。尾巨桉樹皮提取物能有效抑制福壽螺離水上爬行為，鼓風(fēng)干燥和冷凍干燥處理組的福壽螺上爬率均明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，抑制效果均優(yōu)于同濃度下的對(duì)照藥劑茶皂素(P<0.05)。兩種干燥方式得到的樹皮提取物對(duì)福壽螺離水上爬的抑制效果差異不顯著(P>0.05)。尾巨桉樹皮提取物具有較強(qiáng)的抑制福壽螺逃離藥液上爬作用，這對(duì)減少藥劑使用劑量，保護(hù)環(huán)境具有非常重要的意義。
表1 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺離水上爬率的影響
注:與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；鼓風(fēng)干燥與冷凍干燥比較，#P<0.05。表2～5同。
Note:Compared with control,*P< 0.05;Hot air drying compare with freeze drying,#P<0.05.The same with the following figure 2 to figure 5.
2.3 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物殺螺活性的影響
表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種干燥方式的樹皮提取物均對(duì)福壽螺表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒殺活性，與空白對(duì)照組相比殺螺效果均顯著(P<0.05)。經(jīng)鼓風(fēng)干燥和冷凍干燥的樹皮提取物處理24 h后，福壽螺的死亡率都達(dá)到85.0%以上，兩者間的殺螺活性差異不顯著(P>0.05)。冷凍干燥的樹皮提取物對(duì)福壽螺72 h的毒殺活性與同濃度下的對(duì)照藥劑茶皂素一致，福壽螺死亡率均到達(dá)100.0%。
表2 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺的毒殺活性
2.4 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足和肝臟蛋白質(zhì)含量的影響
蛋白質(zhì)是生物體最重要的組分之一，它是與生命及各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)，其含量高低可以反映機(jī)體生命活動(dòng)和生理功能水平。兩種干燥方式的樹皮提取物對(duì)福壽螺組織蛋白質(zhì)含量的影響見表3。與空白對(duì)照組相比，冷凍干燥的樹皮提取物能明顯降低福壽螺頭足中蛋白質(zhì)水平(P<0.05)，兩種干燥方式的樹皮提取物均能降低福壽螺肝臟中蛋白質(zhì)含量，但與空白對(duì)照比較均無顯著性差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明經(jīng)尾巨桉樹皮提取物降低了福壽螺體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量，可能造成其營養(yǎng)不良，進(jìn)而影響其調(diào)節(jié)代謝、機(jī)體防御等特殊功能，最終導(dǎo)致福壽螺死亡[17]。
2.5 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足和肝臟酶活性的影響
AKP、LDH、AST/GOT和ALT/GPT為福壽螺軟體組織中重要酶，參與一系列神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝等相關(guān)的催化反應(yīng)[18]。由表4和5可知，鼓風(fēng)干燥和冷凍干燥的樹皮提取物均可抑制福壽螺頭足部中LDH、 AKP 和AST/GOT的活性(P<0.05)以及肝臟中ALT/GPT和AST/GOT的活性(P<0.05)。尾巨桉樹皮提取物可能通過作用于福壽螺體內(nèi)具有生物活性的酶繼而導(dǎo)致其死亡。LDH是無氧呼吸過程中的重要酶，經(jīng)尾巨桉樹皮提取物處理后福壽螺頭足中LDH受到抑制，表示該組織無氧呼吸的減弱，無氧能量代謝過程受到了影響[19]，而肝臟中LDH變化不大(P>0.05)。AKP與蛋白質(zhì)的合成有關(guān)[20]，在細(xì)胞膜進(jìn)行主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中有著重要作用[21]。AST/GOT和ALT/GPT是蛋白質(zhì)代謝過程中起關(guān)鍵作用的氨基轉(zhuǎn)移酶，在三羧酸循環(huán)中起非常重要的作用[19]。經(jīng)尾巨桉樹皮提取物處理后福壽螺頭足部的AKP和AST/GOT以及肝臟中的AST/GOT和ALT/GPT活性降低，間接證明了尾巨桉樹皮提取物影響福壽螺體內(nèi)蛋白的合成。LDH、AKP、AST/GOT和ALT/GPT可能是植物源殺螺劑尾巨桉樹皮提取物的作用靶點(diǎn)。冷凍干燥的樹皮提取物對(duì)福壽螺頭足和肝臟中AKP和AST/GOT的抑制效果均高于鼓風(fēng)干燥的樹皮提取物(P<0.05)，說明冷凍干燥有利于提高尾巨桉樹皮提取物的生物活性。
表3 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺頭足和肝臟蛋白質(zhì)含量(40 h)的影響
表4 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺頭足酶活性(40 h)的影響
表5 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺肝臟酶活性(40 h)的影響
3 結(jié)論
本研究初步探討了尾巨桉樹皮在防治福壽螺方面的開發(fā)和利用價(jià)值。研究結(jié)果表明尾巨桉樹皮的乙醇提取物對(duì)福壽螺表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺螺活性，能夠有效抑制福壽螺的離水上爬行為，經(jīng)尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺軟體組織中的蛋白質(zhì)含量及乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均有所降低，尾巨桉樹皮有望成為新的植物源殺螺劑。與鼓風(fēng)干燥相比，冷凍干燥能夠更好保持尾巨桉樹皮提取物中的活性成分(三萜類化合物)，提高其殺螺活性。綜上所述，尾巨桉樹皮來源豐富，易采集，成本低，對(duì)環(huán)境安全無污染，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種極具開發(fā)潛力的植物源殺螺劑，本研究結(jié)果將為其進(jìn)一步的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
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桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物，是世界上種植面積最廣的樹種之一。桉樹皮中含有單寧[6]、三萜[7-9]、間苯三酚、黃酮類、單萜、酚酸、甾醇等化學(xué)成分[10-12]，是一種可以重復(fù)利用的生物資源。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)桉樹皮提取物對(duì)福壽螺具有很強(qiáng)的毒殺活性，其主要的活性成分為五環(huán)三萜類化合物[8,9]，可能是一種有開發(fā)潛力的植物源殺螺藥劑，值得進(jìn)一步研究其作用機(jī)理。桉樹皮作為桉樹木材加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，資源非常巨大。桉樹在我國的種植面積已達(dá)450 hm2，年產(chǎn)木材超過3 000萬m3[13]，根據(jù)桉樹皮產(chǎn)量為原木產(chǎn)量的11%計(jì)算[14]，年產(chǎn)桉樹皮約330萬m3。目前，我國絕大部分桉樹皮通常被直接丟棄，其中的活性物質(zhì)沒有得到充分利用造成了巨大的浪費(fèi)。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
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1.1.2 供試軟體動(dòng)物
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1.1.3 主要儀器和試劑
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1.2 方法
1.2.1 尾巨桉樹皮乙醇提取物的制備
取新鮮剝落的尾巨桉樹皮，置于通風(fēng)陰涼處陰干至水分含量為9%，粉碎后過60目篩。分別稱取200.0 g尾巨桉樹皮粉末，按料液比為1 g∶40 mL的比例，分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、60%、80%、90%的乙醇水溶液，超聲波提取2 h(功率500 w，溫度60 ℃)，經(jīng)布氏漏斗抽濾后收集濾液。上述過程重復(fù)2次，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上述濾液減壓濃縮得到樹皮乙醇提取物浸膏，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 尾巨桉樹皮乙醇提取物的干燥處理
稱取在4 ℃冰箱中保存的尾巨桉樹皮乙醇提取物浸膏，分別置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱及冷凍干燥機(jī)中干燥至恒重。鼓風(fēng)干燥條件為40 ℃，干燥24 h。冷凍干燥條件為，先在-20 ℃冰箱中預(yù)凍24 h，冷阱溫度-40 ℃，真空度0.025 MPa，干燥時(shí)間約48 h。兩種不同干燥方式干燥后的樹皮乙醇提取物研磨成粉末后過篩(100目)，分別放入密封袋內(nèi)保存，用于活性成分和生物活性測(cè)定。
1.2.3 尾巨桉樹皮提取物的總?cè)坪繙y(cè)定
分別吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL(相當(dāng)于熊果酸0～58.5 μg)置于10 mL比色管中， 60 ℃水浴蒸干后加入0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸，混勻，然后加1 mL高氯酸，混勻，在60 ℃水浴中加熱15 min后移入冰浴中冷卻，加入5 mL冰醋酸，充分混勻，于548 nm處測(cè)定并記錄吸光度值，以熊果酸質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
準(zhǔn)確稱取0.05 g樹皮乙醇提取物粉末，用30 mL氯仿轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，超聲波提取30 min，取出冷卻至室溫，用氯仿加至刻度，搖勻，取上清液0.5 mL置于10 mL比色管中，在60 ℃水浴蒸干，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作操作步驟，在548 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度[15]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式計(jì)算樣品液三萜含量。
W%=[(C×V1)/(m×V2)]×100 (1)
式中：W-樣品中三萜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)； C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得樣品測(cè)定液中總?cè)频暮?μg)；V1-樣品測(cè)定液總體積(mL)；m-尾巨桉樹皮乙醇提取物的質(zhì)量(g)；V2-測(cè)定時(shí)所取的樣品測(cè)定液體積(mL)。
1.2.4 福壽螺室內(nèi)毒殺活性測(cè)定
采用藥劑浸泡法進(jìn)行殺螺活性試驗(yàn)[16]。稱取一定量的待測(cè)樣品，用甲醇溶解，然后用去氯水配制成50 mg/L的溶液(甲醇含量不超過2%)，以相同含量的甲醇去氯水做空白對(duì)照。用燒杯盛放200 mL藥液，每杯放入20頭幼螺，放入生菜，杯口用紗布封口以防其逃逸。實(shí)驗(yàn)開始后，連續(xù)觀察和記錄2、6、24 h福壽螺的離水上爬情況，分別于處理24、48、72 h觀察和記錄福壽螺的死亡情況，計(jì)算福壽螺的上爬率和校正死亡率。
1.2.5 福壽螺頭足和肝臟中蛋白質(zhì)含量和酶活性測(cè)定
用50 mg/L的尾巨桉樹皮提取物浸泡福壽螺，另設(shè)去氯水為空白對(duì)照。分別于40 h隨機(jī)取5只活福壽螺，用去氯水洗凈，去殼取出福壽螺的頭足和肝臟部分，用吸水紙吸干福壽螺表面的水分，于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。分別稱取1 g福壽螺頭足部和肝臟組織，按福壽螺組織重量1∶5的比例，加入0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液，用微量電動(dòng)勻漿器于4 ℃勻漿，將待測(cè)組織勻漿離心分離(4 ℃，3 500 rpm，15 min)，然后取上清液采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定福壽螺頭足和肝臟中蛋白質(zhì)含量，參照試劑盒說明書分別測(cè)定福壽螺頭足和肝臟中的LDH、AKP、ALT/GPT和AST/GOT酶活性。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析
每個(gè)樣品設(shè)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用Excel 2010和SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)間差異分析。測(cè)定結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.05為差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物中三萜類物質(zhì)含量的影響
以不同體積分?jǐn)?shù)(40%、60%、80%和90%)的乙醇溶液作為提取溶劑提取尾巨桉樹皮，分別采用鼓風(fēng)干燥和冷凍干燥兩種方式干燥提取液浸膏，測(cè)定各組提取液中總?cè)频暮?。由圖1可知，不同體積分?jǐn)?shù)的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)频暮烤尸F(xiàn)顯著性差異。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)到達(dá)60%時(shí)，尾巨桉樹皮提取物中總?cè)坪孔罡撸娘L(fēng)干燥和冷凍干燥的樹皮提取物中總?cè)坪糠謩e達(dá)到10.81%和13.90%。因此，本實(shí)驗(yàn)選取60%乙醇溶液作為尾巨桉樹皮的提取溶劑。在提取條件相同的情況下，冷凍干燥的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪慷济黠@高于鼓風(fēng)干燥的樹皮乙醇提取物(P<0.05)，表明冷凍干燥過程中活性成分損失少，能更好保持尾巨桉樹皮提取物中的三萜類活性物質(zhì)。
圖1 不同干燥方式的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪縁ig.1 Total triterpenoids content of E.urophylla×E.grandis bark extracts drying by different methods 注：圖中小寫字母不同時(shí)，表示差異顯著(P <0.05)。Note:The data in the same column followed by different letters are significant different among treatments (P <0.05).
2.2 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物抑制福壽螺離水上爬的影響
尾巨桉樹皮提取物抑制福壽螺離水上爬的效果見表1。尾巨桉樹皮提取物能有效抑制福壽螺離水上爬行為，鼓風(fēng)干燥和冷凍干燥處理組的福壽螺上爬率均明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，抑制效果均優(yōu)于同濃度下的對(duì)照藥劑茶皂素(P<0.05)。兩種干燥方式得到的樹皮提取物對(duì)福壽螺離水上爬的抑制效果差異不顯著(P>0.05)。尾巨桉樹皮提取物具有較強(qiáng)的抑制福壽螺逃離藥液上爬作用，這對(duì)減少藥劑使用劑量，保護(hù)環(huán)境具有非常重要的意義。
表1 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺離水上爬率的影響
注:與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；鼓風(fēng)干燥與冷凍干燥比較，#P<0.05。表2～5同。
Note:Compared with control,*P< 0.05;Hot air drying compare with freeze drying,#P<0.05.The same with the following figure 2 to figure 5.
2.3 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物殺螺活性的影響
表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種干燥方式的樹皮提取物均對(duì)福壽螺表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒殺活性，與空白對(duì)照組相比殺螺效果均顯著(P<0.05)。經(jīng)鼓風(fēng)干燥和冷凍干燥的樹皮提取物處理24 h后，福壽螺的死亡率都達(dá)到85.0%以上，兩者間的殺螺活性差異不顯著(P>0.05)。冷凍干燥的樹皮提取物對(duì)福壽螺72 h的毒殺活性與同濃度下的對(duì)照藥劑茶皂素一致，福壽螺死亡率均到達(dá)100.0%。
表2 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺的毒殺活性
2.4 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足和肝臟蛋白質(zhì)含量的影響
蛋白質(zhì)是生物體最重要的組分之一，它是與生命及各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)，其含量高低可以反映機(jī)體生命活動(dòng)和生理功能水平。兩種干燥方式的樹皮提取物對(duì)福壽螺組織蛋白質(zhì)含量的影響見表3。與空白對(duì)照組相比，冷凍干燥的樹皮提取物能明顯降低福壽螺頭足中蛋白質(zhì)水平(P<0.05)，兩種干燥方式的樹皮提取物均能降低福壽螺肝臟中蛋白質(zhì)含量，但與空白對(duì)照比較均無顯著性差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明經(jīng)尾巨桉樹皮提取物降低了福壽螺體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量，可能造成其營養(yǎng)不良，進(jìn)而影響其調(diào)節(jié)代謝、機(jī)體防御等特殊功能，最終導(dǎo)致福壽螺死亡[17]。
2.5 干燥方式對(duì)尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足和肝臟酶活性的影響
AKP、LDH、AST/GOT和ALT/GPT為福壽螺軟體組織中重要酶，參與一系列神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝等相關(guān)的催化反應(yīng)[18]。由表4和5可知，鼓風(fēng)干燥和冷凍干燥的樹皮提取物均可抑制福壽螺頭足部中LDH、 AKP 和AST/GOT的活性(P<0.05)以及肝臟中ALT/GPT和AST/GOT的活性(P<0.05)。尾巨桉樹皮提取物可能通過作用于福壽螺體內(nèi)具有生物活性的酶繼而導(dǎo)致其死亡。LDH是無氧呼吸過程中的重要酶，經(jīng)尾巨桉樹皮提取物處理后福壽螺頭足中LDH受到抑制，表示該組織無氧呼吸的減弱，無氧能量代謝過程受到了影響[19]，而肝臟中LDH變化不大(P>0.05)。AKP與蛋白質(zhì)的合成有關(guān)[20]，在細(xì)胞膜進(jìn)行主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中有著重要作用[21]。AST/GOT和ALT/GPT是蛋白質(zhì)代謝過程中起關(guān)鍵作用的氨基轉(zhuǎn)移酶，在三羧酸循環(huán)中起非常重要的作用[19]。經(jīng)尾巨桉樹皮提取物處理后福壽螺頭足部的AKP和AST/GOT以及肝臟中的AST/GOT和ALT/GPT活性降低，間接證明了尾巨桉樹皮提取物影響福壽螺體內(nèi)蛋白的合成。LDH、AKP、AST/GOT和ALT/GPT可能是植物源殺螺劑尾巨桉樹皮提取物的作用靶點(diǎn)。冷凍干燥的樹皮提取物對(duì)福壽螺頭足和肝臟中AKP和AST/GOT的抑制效果均高于鼓風(fēng)干燥的樹皮提取物(P<0.05)，說明冷凍干燥有利于提高尾巨桉樹皮提取物的生物活性。
表3 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺頭足和肝臟蛋白質(zhì)含量(40 h)的影響
表4 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺頭足酶活性(40 h)的影響
表5 尾巨桉樹皮提取物對(duì)福壽螺肝臟酶活性(40 h)的影響
3 結(jié)論
本研究初步探討了尾巨桉樹皮在防治福壽螺方面的開發(fā)和利用價(jià)值。研究結(jié)果表明尾巨桉樹皮的乙醇提取物對(duì)福壽螺表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺螺活性，能夠有效抑制福壽螺的離水上爬行為，經(jīng)尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺軟體組織中的蛋白質(zhì)含量及乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均有所降低，尾巨桉樹皮有望成為新的植物源殺螺劑。與鼓風(fēng)干燥相比，冷凍干燥能夠更好保持尾巨桉樹皮提取物中的活性成分(三萜類化合物)，提高其殺螺活性。綜上所述，尾巨桉樹皮來源豐富，易采集，成本低，對(duì)環(huán)境安全無污染，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種極具開發(fā)潛力的植物源殺螺劑，本研究結(jié)果將為其進(jìn)一步的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
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