齊少瑋 ，閆彩燕 ，郭佳 ，吳則東 ，興旺

（1.國家甜菜種質(zhì)中期庫/黑龍江大學，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所/黑龍江大學農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；4.哈爾濱師范大學，哈爾濱150025）

0 引言

自21世紀以來，我國甜菜種子市場引起國外育種公司注意，國外育種公司生產(chǎn)的甜菜品種具有易存活、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、種子處理技術(shù)先進等優(yōu)點[1]。當前國外的甜菜品種幾乎占據(jù)了中國甜菜種子的全部市場，其中進口比重較大的是德國和比利時，各占37.2%和36.8%，其次是意大利，占14.6%，進口種子的77.6%用于種植生產(chǎn)原料；我國的國產(chǎn)新品種也在不斷研發(fā)中[1]。但與此同時市場上開始出現(xiàn)了一些假冒偽劣的甜菜種子，由于引進的種子多采用包衣或丸粒化處理，購買者無法從外形上辨別甜菜品種，也沒有完善的技術(shù)手段進行檢驗，導致出現(xiàn)某品種純度不夠或品種張冠李戴的情況，這種情況嚴重損害了農(nóng)民以及育種家的利益，因此開發(fā)出一套快速、準確鑒定甜菜品種的方法成為當務之急。

品種鑒定可以檢驗種子中是否摻入了其他品種，保證品種的真實性和一致性，世界各國都十分重視品種真實性及純度的鑒定，我國也針對品種鑒定制定了一系列的法律法規(guī)來規(guī)范種子市場。以往采用形態(tài)學方法[3]，如種子形狀、顏色、大小等。由于甜菜遺傳基礎比較狹窄、親緣關(guān)系較近[4-5]，能真正應用于鑒定中的形態(tài)特征又比較少，使這種方法檢測周期時間長、不易區(qū)分，形態(tài)學辨別相近品種較為困難。DNA分子標記技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標記形式，目前已廣泛應用到了甜菜育種各方面，其主要包括RAPD[6-7]、AFLP[3，7]、SSR[8]、SNP[9]，這些標記表現(xiàn)出基因之間的實際遺傳變異水平，得到的結(jié)果更加直接、準確，已在生物學領(lǐng)域得到了廣泛應用。以分子標記為基礎構(gòu)建的DNA指紋圖譜則可以有效鑒定作物品種，指紋圖譜針對每一個品種都有其獨特性、差異性，使其鑒定結(jié)果準確、可靠的同時，又節(jié)省了大量的時間，是快速、簡單、高效的科學鑒別手段，近年來已經(jīng)在多種作物鑒定研究中得到了快速發(fā)展，是當前鑒定品種、構(gòu)建指紋圖譜和進行遺傳多樣性分析的主要方法[3，10-11]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat，簡單重復序列間區(qū)）是Zietkiewicz等人于1994年提出的一種新型分子標記技術(shù)[12]，其原理是用錨定的微衛(wèi)星DNA做引物，在3′端或5′端隨機加入2～4個核苷酸，利用單一引物進行擴增。ISSR引物具有通用性，它結(jié)合了SSR、RAPD和AFLP分子標記的技術(shù)優(yōu)點，即引物設計簡單、重復性好、多態(tài)性高、開發(fā)應用成本較低等。目前，國內(nèi)外ISSR分子標記技術(shù)在植物遺傳多樣性分析研究、構(gòu)建指紋圖譜、品種鑒定等方面已有了廣泛應用[11]。Wu等[13]利用14個ISSR引物對33個李子品種進行遺傳多樣性分析并確定了其種群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)部；Hossein等[14]利用22個ISSR引物對苦味和甜味阿魏進行遺傳分化研究，結(jié)果表明ISSR分子標記適合于研究其種群的遺傳多樣性，可將相同屬的種群與相似的種質(zhì)區(qū)分開；謝玥等[15]用篩選出的10條ISSR引物擴增了25個獼猴桃品種，對其進行品種和種質(zhì)資源材料遺傳多樣性分析并構(gòu)建出ISSR指紋圖譜，在相似系數(shù)水平為0.604時，可將試驗品種聚為3類。但截止到目前，我國有關(guān)ISSR甜菜品種DNA指紋圖譜構(gòu)建有研究基礎，但報道還不多，劉華君等[16]、付增娟等[17]首先建立了一套適合于甜菜ISSR優(yōu)化反應體系及程序并進行了驗證，使用優(yōu)化后的體系和篩選的引物，僅用1條ISSR引物就成功地區(qū)分了10個甜菜品種并建立了指紋圖譜；劉巧紅等[18]利用2條ISSR引物可以將10個甜菜品種完全區(qū)分出來。

本試驗以39個甜菜品種為試驗材料，運用ISSR分子標記技術(shù)構(gòu)建甜菜品種指紋圖譜的研究，以期為快速鑒定甜菜品種提供科學的理論依據(jù)，為育種家維護權(quán)利提供技術(shù)支持以及保護農(nóng)民的利益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑及儀器

1.1.1 試驗材料

試驗所用的品種均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全國農(nóng)業(yè)技術(shù)中心提供，所有品種都在黑龍江大學農(nóng)作物研究院溫室中進行栽培，并在黑龍江大學甜菜遺傳育種重點實驗室進行試驗分析。品種來源及其名稱見表1。

表1 供試驗的甜菜品種Table 1 Sugar beet varieties for trial

ISSR引物：試驗所用的引物序列均來自美國加拿大哥倫比亞大學設計并公布的100條ISSR引物，試驗引物都是由上海生工生物有限公司合成的，采用HAP純化。

1.1.2 主要試劑

CTAB、Mix、Loading Buffer、瓊脂糖、TEMED、TBE、EDTA、硼酸、乙醇、冰醋酸、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛等（實驗室所用藥品均購于哈爾濱瀚博化學試劑公司）。

1.1.3 儀器設備

震蕩研磨機（Retsch MM40）、紫外分光光度計（Thermo NanoDrop 2000）、高速冷凍離心機（Thermo Scientific SorvallStratos）、PCR儀（Applied BiosystemsVeriti）、電泳槽（北京六一儀器公司）、電泳儀(Bio-Rad PowerPAC 200)、迷你混合儀（MIULAB Mini-10K）、微孔板離心機（MIULAB MINIP-2500）、簡潔型白光透射儀（海門麒麟GL-800）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取

將要進行試驗的甜菜種子播種于黑龍江大學農(nóng)作物研究院溫室營養(yǎng)缽中，待種子長出4片真葉時，每個品種取5株，用剪子將幼苗剪斷后裝入2 mL離心管，在每個離心管中加入一顆鋼珠并在管蓋及管壁上做好標記。將所有樣品放入液氮中浸泡3～5 min，然后用震蕩研磨機以30 r/s的頻率震蕩1 min 30 s，震蕩并確認所有樣本均已被打碎后，使用CTAB法[19]進行DNA的提取。

最后利用紫外分光光度計測量DNA的純度及濃度，在管壁上進行標記，并將其濃度稀釋至10 ng/μL。

1.2.2 ISSR-PCR反應體系

PCR總反應體系為5 μL，其中含有Mix 2.5 μL，引物（質(zhì)量濃度為10 μmol/L）0.2 μL，模板DNA（質(zhì)量濃度為10 μmol/L）1 μL，最后加入滅菌雙蒸水補充至5 μL，振蕩混勻。

1.2.3 ISSR-PCR反應程序

反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，退火溫度從65～51℃每降一度循環(huán)進行2次；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，15個循環(huán)；最后72℃延伸5 min；4℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

在擴增后的產(chǎn)物中加入1 μL Loading Buffer，用微孔板離心機進行離心。使用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓設定為180 V，電泳90 min。電泳結(jié)束后，利用快速銀染法[20]進行漂洗、染色、顯影成像，并置于簡潔型白光透射儀上拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)記錄

記錄成像清晰的DNA擴增條帶，對比不同品種的條帶有無重復。統(tǒng)計每個品種ISSR擴增圖譜在同一位置上有無條帶，如果有條帶記為1，無條帶記為0，構(gòu)建“0，1”矩陣，將統(tǒng)計結(jié)果輸入Excel表格，統(tǒng)計條帶數(shù)和多態(tài)性比率。應用Mega軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析。多態(tài)性位點百分率P=（k/n）×100%，其中k為多態(tài)性位點的數(shù)目；n為檢測到的位點總數(shù)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物篩選與多態(tài)性分析

利用前期篩選的多態(tài)性好的引物ISSR826和ISSR827對39個試驗材料的基因組進行擴增。這2條引物共擴增出27個條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為23條，平均多態(tài)性比率為85.2%，擴增出的DNA片段基本集中在150～400 bp之間，一小部分片段超過400 bp。ISSR826引物共擴增出7條譜帶，其中有5條條帶為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為71.4%。ISSR827引物共擴增出20條譜帶，其中有18條條帶為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)率為90.0%。這2條引物擴增出的條帶數(shù)和多態(tài)性水平有較大差異。2條引物的擴增結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 ISSR826引物的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of ISSR826 primers

圖2 ISSR827引物的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification results of ISSR827 primers

2.2 39個甜菜品種的聚類分析

利用Mega7.0軟件進行聚類分析并處理編輯，結(jié)果見圖3。

根據(jù)親緣關(guān)系的遠近，在所有品種中HX910和XV1433與其余所有品種的親緣關(guān)系最遠，可以單獨分為一支。將剩下的37個品種作為第二支，根據(jù)親緣關(guān)系繼續(xù)分成了6組，其中MA11-8又與其他品種親緣關(guān)系較遠，單獨分成第一組；第二組為 KWS2314、SR496、KWS1176、IM1162、BETA796、COFCO1001、LS1210、H7IM15；第 三 組 為 Flores、VF3019、SV1375；第 四 組 為 ADV0401、IM802；第 五 組 為 MA2070、BTS705、KWS1231、KUHN8060、AK3018、KUHN1225、SV893、SD12830、BETA468、H003；第 六組為 PJ1、BTS5950、BTS8840、愛 麗 斯 、KUHN8062、HI0936、SD13829、BETA176、MA3005、KWS1197、KUHN1387、MA10-4、KWS9147。在所有分支中，第五組和第六組所含品種數(shù)量較多，分別為10個（占總數(shù)的25.6%）和13個（占總數(shù)的33.3%）。

圖 339個甜菜品種的聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of 39 sugar beet varieties

由結(jié)果分析可知，試驗品種的親緣關(guān)系與其所在公司的關(guān)系并不大，各公司的各個品種在每一小組中都有不同程度的分布。但也有個別同公司品種聚在一起的情況，如BTS8840和BTS5950。這說明每個公司在育種時及投放市場時，并沒有全部采用親緣關(guān)系較近的親本，它們的品種父母本組合廣泛、多樣化。

2.3 構(gòu)建ISSR指紋圖譜

利用ISSR826、ISSR827對39個甜菜品種的擴增譜帶進行分析，這2條引物對應的大部分品種都有其獨特的特征譜帶，其中利用引物ISSR827可以區(qū)分37個品種，ISSR827無法區(qū)分品種22和34號品種，而這2個品種可以利用ISSR826區(qū)分出來。在實際生產(chǎn)應用中，只要用相應的引物對所鑒定的品種進行擴增，利用特征譜帶法，將擴增結(jié)果與標準指紋圖譜進行條帶對比，就可鑒別品種的真實性和純度。將這2條引物組合在一起，即ISSR826和ISSR827就可以完全區(qū)分出39個甜菜品種，由此利用這2條引物構(gòu)建了全部39份甜菜品種的數(shù)字指紋圖譜。

3 討論與結(jié)論

以往依靠表型特征等方法鑒別甜菜品種的方法受環(huán)境等因素影響大，鑒別難度大、錯誤率較高，加之甜菜種質(zhì)資源的不斷擴充、品種數(shù)量的不斷增加，品種間的相似度也逐漸增高、親緣關(guān)系越來越近，所以采用傳統(tǒng)的分析鑒定方法來區(qū)分甜菜品種也愈發(fā)困難。由于DNA受環(huán)境等因素影響較小，多態(tài)性高，利用DNA擴增的分子標記方法已經(jīng)成為鑒定甜菜品種及其他作物品種的主要方法。加之ISSR分子標記技術(shù)在甜菜品種鑒定上的應用較少，本試驗運用兩條ISSR引物ISSR826、ISSR827擴增條帶構(gòu)建的指紋圖譜，運用特征譜帶法就可以將39個甜菜品種的真實性和純度區(qū)分鑒定出來。這說明ISSR是一種較為理想的構(gòu)建甜菜品種指紋圖譜的分子標記技術(shù)，證明了其在遺傳多樣性研究及親緣關(guān)系分析中具有巨大的應用價值，加快了甜菜分子生物學各領(lǐng)域的發(fā)展，為ISSR分子標記在甜菜種質(zhì)鑒別及在其他作物的應用上做出了貢獻。

本研究篩選出的2條ISSR引物對于特定的品種具有特征譜帶，在單獨使用時均可鑒定分別出一定數(shù)量的品種。隨著甜菜品種數(shù)量的增加，其原有的特征譜帶可能與新品種的擴增條帶重復一致，且應用引物數(shù)量有限、條帶數(shù)量不夠多，所以此方法如今只能針對一些特別實驗范圍、特別品種。若想獲得更多的特征譜帶，還需進行大量的核心引物篩選。目前所開發(fā)的ISSR引物僅有100條，能真正應用于甜菜作物的ISSR引物更具有局限，未來隨著分子生物學的不斷發(fā)展、引物不斷設計開發(fā)，能篩選應用的核心引物將越來越多。將幾個引物組合運用，將結(jié)果補充到現(xiàn)有的圖譜中，構(gòu)建品種更多更豐富的指紋圖譜，為甜菜品種純度及真實性的鑒定提供強大的理論支撐，使每一個甜菜品種都有其專門的分子身份證，未來有望為育種家選育攜帶優(yōu)良性狀的品種提供輔助[21]。

本實驗在100條ISSR引物中篩選出合適的2條引物作為核心引物，運用這2條ISSR核心引物，成功構(gòu)建了39個甜菜品種的指紋圖譜，可用于甜菜品種的鑒定。