桑圣剛，張瑞，徐亞晨，桑賢正，肖曼

(1海南醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院 檢驗科，?？?570102；2海南醫(yī)學院 臨床學院，?？?571199;3海軍軍醫(yī)大學，上海 200433；4 海南醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院，海口 71199)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是世界范圍內最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一.慢性HBV感染可導致肝纖維化，肝硬化和肝癌[1,2].針對乙型肝炎的深入研究和有效控制十分迫切.目前臨床上針對乙型肝炎的抗病毒藥物均存在一定的缺陷.海南地區(qū)民間及臨床上治療乙型肝炎均發(fā)現(xiàn)，南藥憂遁草(Clinacanthusnutans)在抗HBV治療上具有很好的功效，但目前其作用機制仍不明了.

憂遁草，又名沙巴舌草，鱷嘴花等，意為“延續(xù)生命”，是重要的傳統(tǒng)醫(yī)藥[3].憂遁草一般以全株或葉片入藥，味甘、辛、微苦，性涼，入肝、腎經，具有清熱解毒、散瘀消腫、利濕利尿、活血疏經、解酒、抗腫瘤等功效.傳統(tǒng)上用于治療多種癌癥、肝炎、黃疸、風濕痹痛、外傷跌打等.憂遁草為良好的慢乙肝引經藥，可疏通人體郁結之肝氣，增強了清熱利濕、滋補肝腎的作用.本研究基于網絡藥理學理念，根據(jù)化合物結構特征預測潛在靶點，篩選建立憂遁草活性成分和乙型肝炎靶點相互作用的蛋白-蛋白相互作用網絡圖，運用網絡藥理學理念和相關技術手段，探索憂遁草治療乙型肝炎的關鍵作用機制，為中草藥抗病毒活性研究、改善常規(guī)抗HBV藥物治療乙肝的缺陷提供新的思路.

1 實驗方法

1.1 憂遁草化學成分挖掘及分析

綜合利用中草藥成分查詢數(shù)據(jù)庫HIT(http://lifecenter.biosino.org/hit/)、TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、NPASS(http://bidd2.nus.edu.sg/NPASS)、TCM-ID(http://bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx)TCM@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)、TCMID(http://www.mega bio net.org/tcmid/search/)及中國知網、萬方數(shù)據(jù)、維普中文期刊全文數(shù)據(jù)庫、Pubmed、科學引文索引(SCI)等常用文獻檢索數(shù)據(jù)庫檢索憂遁草查詢其所有化合物成分，檢索詞為“憂遁草”、“鱷嘴花”、“沙巴舌草”、“Clinacanthusnutans”、“you dun cao”等，將所有化合物名稱整理成EXCEL表格.使用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)平臺對各化合物分子結構進行確證，保存各化合物SMILES結構式、化合物2D、3D結果SDF文件備用.利用Linpinski 五規(guī)則查詢化合物ADME信息，分析各化合物的類藥性，具體內容包括分子量小于500 ；氫鍵供體數(shù)目小于5；氫鍵受體數(shù)目小于10；脂水分配系數(shù)小于5.符合Lipinski規(guī)則的化合物會有更好的藥代動力學性質，在生物體內代謝過程中會有更高的生物利用度.如果化合物違背5規(guī)則(違背2項以上)，則該化合物很難成藥.

1.2 憂遁草化學成分作用靶點預測

綜合使用STITCH(http://stitch.embl.de/)、Swiss target prediction(http://swisstarget prediction.ch/)在線分析軟件及TargetNet (http://targetnet.scbdd.com)QSAR模型靶點預測數(shù)據(jù)庫，預測憂遁草中有效化學成分的作用靶點，并將結合分數(shù)大于0.5的大分子蛋白作該成分的有效靶點，提取作用靶基因名稱構建憂遁草化學成分靶點交互作用網絡.

1.3 憂遁草“成分- 靶點”網絡構建

應用在線OMIM(https://omim.org/)、DisGeNET(http://www.disgenet.org/)、GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)常用疾病基因數(shù)據(jù)庫獲取乙型肝炎相關基因.多數(shù)據(jù)庫檢索已報道的乙型肝炎相關蛋白，提取80%以上疾病基因，作為疾病特異性靶基因.通過對于憂遁草有效成分的靶蛋白及乙型肝炎疾病靶點交叉分析，獲取憂遁草治療乙型肝炎的核心靶點，使用 Cytoscape 軟件(Version3.6.1, http: //www.cytoscape.org)構建藥物-成分-靶點關系網絡.整個網絡展示成分-靶點之間的聯(lián)系，通過構建這一網絡探析憂遁草治療乙型肝炎的作用機制.

1.4 憂遁草治療乙型肝炎蛋白質交互作用網絡(PPI)

將憂遁草的類藥活性成分所映射的靶基因和乙型肝炎相關的疾病基因進行維恩分析，獲得兩者的交叉共同基因即為憂遁草治療乙型肝炎的核心靶點.將憂遁草治療乙型肝炎的靶點導入STRING(https://string-db.org/)及 GeneMANIA(http://genemania.org/)蛋白質交互作用網絡分析網站，構建憂遁草治療慢性乙型肝炎蛋白質交互作用網絡.

1.5 憂遁草治療乙型肝炎GO分析與KEGG分析

生物信息數(shù)據(jù)庫DAVID整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表(成百上千個基因ID或者蛋白ID列表)提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，并可進行基因本體(GO)分析和KEGG通路分析，借此挖掘特定基因或蛋白的生物學意義.將關鍵靶點基因輸入David數(shù)據(jù)庫功能注釋工具中(Version 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)，GO富集分析選擇生物過程(biological process)，分子功能(molecular function)，和細胞組成(cellular component)3 個模塊，通路分析選擇 KEGG，設定P<0.05 以確定關鍵靶點富集通路.使用OMICshare將富集結果繪制成高級氣泡圖(圖5).

2 結果

2.1 憂遁草化學成分挖掘及分析

經數(shù)據(jù)庫檢索整理共獲得憂遁草化合物59種，將名稱整理成EXCEL表格使用PubChem平臺對各化合物分子結構進行確證，保存化合物SMILES結構式，在線分析平臺TargetNet查詢化合物Linpinski 五規(guī)則，ADME信息，分析各化合物的類藥性，篩選出五規(guī)則符合度高于75%的27種化合物作為進一步分析的類藥化合物.化合物信息見表1.

表1 憂遁草27種類藥性化合物信息

2.2 憂遁草化學成分作用靶點預測

使用STITCH、Swiss target prediction在線分析軟件及TargetNet QSAR模型靶點預測數(shù)據(jù)庫，預測憂遁草中有效化學成分的作用靶點，獲得27種類藥成分靶點共1758個，篩選成分-靶點結合分數(shù)>0.5的靶基因，共獲得271個興趣基因，應用在線OMIM、DisGeNET、GEO常用疾病基因數(shù)據(jù)庫獲取乙型肝炎相關基因.多數(shù)據(jù)庫檢索檢索已報道乙型肝炎相關蛋白，提取80%以上疾病基因，獲得乙型肝炎疾病特異性靶基因282個，將藥物興趣基因與疾病特異性靶點進行維恩分析，獲得關鍵靶基因20個，分別為TNF、CASP9、APOBEC3G、IKBKB、TGFBR1、PTPRC、CASP3、MAPK10、AR、HNF4A、RELA、RARB、CDK2、AKT1、MET、PIK3CG、PIK3CA、BCL2、PIK3CB、PIK3CD.結果如圖1所示.

圖1 憂遁草類藥成分靶基因與乙肝疾病基因維恩分析

2.3 憂遁草“成分- 靶點”網絡構建

將獲得的20個關鍵靶基因映射所屬類藥成分，發(fā)現(xiàn)27種類藥成分中有16種成分參與對關鍵靶基因的調控，構建成分-靶點關系對文件，使用Cytoscape軟件構建成分-靶點關系網絡圖，通過節(jié)點屬性可知連接度前三位的成分分別為isovitexin、beta-Sitosterol、phytol，這可能為憂遁草治療乙型肝炎的關鍵化合物.結果見圖2.

2.4 憂遁草治療慢性乙型肝炎靶點蛋白質交互作用網絡

將憂遁草治療乙型肝炎的靶點導入STRING及 GeneMANIA 蛋白質交互作用網絡分析網站，構建憂遁草治療慢性乙型肝炎蛋白質交互作用網絡PPI文件，利用Cytoscape 軟件進行關鍵節(jié)點分析，通過節(jié)點連接度大小呈現(xiàn)關鍵靶基因的權重，使用節(jié)點大小及顏色深淺凸顯靶基因在乙肝疾病治療中的不同作用，共獲得20個節(jié)點，68個相互關系，其中TNF、AKT1、PIK3CA、CAS3、CAS9處于節(jié)點關鍵位置，表明它們是治療疾病的核心蛋白.具體結果見圖3.

綠色為關鍵靶基因，紅色為有效成分

通過顏色深淺與形狀大小顯示出Hub節(jié)點

2.5 憂遁草治療乙型肝炎GO分析與KEGG分析

使用DAVID 進行基因本體(GO)分析和 KEGG 通路分析.將關鍵靶點基因輸入David數(shù)據(jù)庫，然后進行GO富集分析KEGG通路分析.使用OMICshare將富集結果繪制成高級氣泡圖.關鍵基因GO功能富集如結果圖4(a)顯示，KEGG 富集出80條通路，去除廣泛通路后，如圖4(b)顯示，排名靠前的主要相關信號通路如下：乙型肝炎疾病通路、癌癥通路、凋亡信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路等.富集結果顯示憂遁草有效成分呈現(xiàn)出通過多靶點多通路達到治療乙型肝炎的可能性.其中作用于乙型肝炎疾病通路的富集結果顯示，化合物通過PI3K/AKT、MAPK、NF-kappa B等免疫或炎癥途徑對乙肝疾病的進展產生影響(圖5).

圖4 關鍵基因GO富集分析(a)與KEGG pathway富集分析(b)

3 討論

當前研究普遍認為HBV感染慢性化的關鍵機制是機體對HBV產生了特異性的免疫耐受.目前臨床上抗HBV主要使用干擾素類、核苷類和中成藥等藥物[4，5],但整體呈現(xiàn)出或總體療效不佳，或不良反應多，亦或導致耐藥性等問題[6，7].中草藥作為天然藥物呈現(xiàn)出抗病毒療效更佳、副作用更小的鮮明特點[8].

憂遁草可能為很好的抗乙肝藥物.本研究中藥物-成分-靶點網絡顯示，憂遁草主要活性成分異牡荊素(isovitexin)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、葉綠醇(phytol)為網絡中的重要節(jié)點，提示它們在憂遁草對乙肝治療中發(fā)揮著重要作用，這與目前的相關研究結果存在很大一致性，證明了虛擬結果的可靠性較高.

圖5 乙型肝炎疾病信號通路基因顯著富集圖

研究表明憂遁草氯仿提取物在體外對多種癌細胞顯示出顯著的抗增殖作用[9].另外，憂遁草增強了CD8+T細胞在炎性或腫瘤細胞的浸潤，激活了CD8+T細胞的功能[10].異牡荊素是很多中草藥的活性成分[11].異牡荊素具有抗炎、抗氧化活性及抗阿爾茨海默病的作用[12]，異牡荊素還具有抗肝癌、乳腺癌和結腸癌的活性[13].β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、抗腫瘤等功效[14].葉綠醇衍生物可通過誘導一系列趨化因子和細胞因子的表達而發(fā)揮免疫刺激活性從而調節(jié)免疫應答[15].這些初步研究提示出憂遁草對于機體免疫功能的調節(jié)與惡性腫瘤的防治有功效，具有極大的成藥潛力與研究價值.

以上結果說明憂遁草可通過多成分、多靶點的協(xié)同作用而充分發(fā)揮作用，為中藥多組分多靶點作用的挖掘與研發(fā)提供了新思路，也為目前鮮有報道的活性成分指明未來深入研究的方向.研究得到憂遁草治療乙肝的關鍵靶點基因20個，進一步的蛋白質相互作用網絡分析顯示TNF、AKT1、PIK3CA、CAS3、CAS9這5個關鍵靶點在網絡中具有重要地位，提示其可作為憂遁草治療乙肝的核心靶點.

腫瘤壞死因子(TNF)是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子.TNF對病毒清除至關重要，TNF有多種途徑發(fā)揮抗病毒活性[16-19].PI3K/Akt信號通路是細胞內外信號轉導一個重要紐帶, 在細胞抗凋亡、增殖、分化以及侵襲轉移中起到至關重要作用[20].PIK3CA是屬于PI3K-Akt信號通路中的一個關鍵原癌基因，蛋白激酶B(AKT1)也是該通路重要分子.caspase家族是一組具有相似氨基酸序列、結構和功能的蛋白水解酶，是細胞凋亡的主要執(zhí)行者.caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細胞毒性T細胞(CTL)殺傷機制的重要組成部分，提示caspase 9蛋白低表達可能導致細胞凋亡機制障礙，細胞增殖失去控制，從而參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程，并與肝細胞的惡性轉化和浸潤轉移相關[21].

GO注釋結果顯示，關鍵靶點涉及的細胞成分為影響細胞質的功能，分子功能主要為干預1-磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、類固醇激素受體活性及影響ATP結合過程.生物過程包括肽基絲氨酸磷酸化的調節(jié)、NF-Kappa B轉錄因子活性調節(jié)、外源性凋亡信號通路的調控、葡萄糖代謝過程、細胞增殖、蛋白激酶B(AKT)過程的調節(jié)、RNA 聚合酶II 啟動子轉錄及基因表達調控等多個層面發(fā)揮作用.這些生物學過程在藥物活性成分抗炎抗病毒機制的發(fā)揮及靶點所涉及的通路都有所體現(xiàn).

此外，研究中藥物關鍵靶點主要富集的通路為乙型肝炎疾病通路、癌癥通路、凋亡信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路等.這些通路都與炎癥的發(fā)生發(fā)展乃至惡性癌變的過程高度相關，通路富集的結果表明憂遁草的活性成分作用的核心靶點映射于不同的通路，可通過各通路協(xié)調共同發(fā)揮藥效，這與目前對靶點基因的相關研究結果及藥物活性成分所能作用的通路基本一致，也為更進一步的機制研究指明方向.

對憂遁草的多成分、多靶點與乙肝疾病間的多元網絡關系的研究結果初步表明了憂遁草主要潛在活性成分及作用靶點、作用病種及相關通路，為進一步深入探討其作用機制提供了新思路，但仍需進一步的基礎研究與臨床實驗為虛擬預測結果作支撐.