王海英，梅毅強，范琪，安達,韋嘉璐，劉柑杏

(中南民族大學 生命科學學院，武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074)

畜禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；a生大量畜禽排泄物和各種廢棄物，畜禽養(yǎng)殖污染成為繼工業(yè)和生活垃圾污染后的第三大污染源[1].微藻可吸收廢水中無機氮和磷的營養(yǎng)物質，通過光合作用合成生物燃料、食物、藥物和化學品的原料[2]，是低成本生產微藻生物質的高度可持續(xù)性過程，被認為是解決能源與環(huán)境問題的理想技術[3].

近年來研究藻菌共生系統(tǒng)處理廢水較多，并取得一定的效果，認為它可作為廢水二、三級處理的替代方法[4].DE-BASHAN等[5]采用促進小球藻生長的巴西固氮螺組成藻菌聯(lián)合體系，對城市污水中的氨氮、硝酸鹽氮和磷的去除效率分別達到100%, 15%和 36%，顯著高于純藻系統(tǒng).JI等[6]比較了兩種藻菌共生系統(tǒng)對合成廢水的處理，發(fā)現(xiàn)小球藻和地衣芽孢桿菌共生系統(tǒng)去除效果較好，化學需氧量(COD)、總氮(TN)、總磷(TP)去除效率分別為86.55%，80.28%和88.95%；而銅綠微囊藻和地衣芽孢桿菌共生系統(tǒng)去除效率僅為65.62% COD，70.82% TDP和21.56% TDN.LIANG等[7, 8]將地衣芽孢桿菌和C.vulgaris構建藻菌共生體系，藻與細菌的細胞密度比例為1∶1時氨氮(NH3-N)去除效率提高至78%，且系統(tǒng)pH值的變化會極大影響系統(tǒng)對營養(yǎng)物的去除效率.這些研究說明藻菌共生系統(tǒng)對廢水的轉化效率不僅與系統(tǒng)中藻和菌的種類有關，且與藻菌共生系統(tǒng)的外部環(huán)境條件有關.

芽孢桿菌對碳系、氮系、磷系污染物具有較強的分解能力，可將氨離子轉化為含氮物質，將磷轉化為磷酸鹽儲存在細胞內[9]，對廢水中的有機物有較強的轉化能力，在廢水處理中廣泛使用[10]，前期研究發(fā)現(xiàn)小球藻、萊茵衣藻等綠藻對廢水具有著良好的凈化作用，生長速度快，處理廢水周期短[11,12]，本文基于對適應豬糞廢水生長的芽孢桿菌的篩選，與萊茵衣藻建立藻菌共生系統(tǒng)，考察該系統(tǒng)對豬糞廢水的凈化的加強，并通過添加少量葡萄糖和芽孢桿菌萌發(fā)劑丙氨酸，探討促進藻菌共生系統(tǒng)產生協(xié)同作用達到豬糞廢水高效率轉化的條件.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

菌種：蠟樣芽胞桿菌(BacilluscereusYS,BacilluscereusSLK)、凝結芽孢桿菌(BacilluscoagulansBS32,BacilluscoagulansBS33)、短小芽孢桿菌(BacilluspumilusBSK9)、地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisBL20368,BacilluslicheniformisZCS,BacilluslicheniformisBS30)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,BacillussubtilisMA139,BacillussubtilisR-179,BacillussubtilisBS20,BacillussubtilisC-3102,BacillussubtilisBS24)由中南民族大學生命科學院生物工程實驗室提供.藻種：萊茵衣藻(ChlamydomonasreinhardtiiFACHB-2217)由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供.COD試劑(1.14538.00065和1.14539.00495，WTW，德國);C6H8O6抗壞血酸(國藥集團化學試劑);(NH4)6Mo7O24·4H2O(重慶北碚化學試劑廠).

消解裝置(XJ-III, 韶關市泰宏醫(yī)療器械);紫外可見分光光度計(752型,上海光譜儀器);全溫搖床(QYC,上海新苗醫(yī)療器械);光學顯微鏡(Motic BA210,廈門麥克奧迪電氣);水質分析儀(Photo Lab S6, 德國WTW).

1.2 藻種和菌種的培養(yǎng)

芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，主要成分：10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，3 g/L牛肉膏，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中200 r/min培養(yǎng)24 h即可.萊茵衣藻用TAP培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，主要成分：2.42 g/L Tris base，10 mL/L TAP-salts溶液(37.5 g/L NH4Cl，10 g/L MgSO4·7H2O,7 g/L CaCl2·2H2O)，1 mL/L磷酸緩沖液(27 g/L K2HPO4,18.5 g/L KH2PO4)，1 mL/L微量金屬元素[50 g/L Na2EDTA，22 g/L ZnSO4·7H2O，5.06 g/L MnCl2·4H2O，0.05 g/L CaCl2·2H2O，11.4 g/L H3BO3，4.99 g/L FeSO4·7H2O，1.10 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O，1.61 g/L CoCl2·6H2O，1.57 g/L CuSO4·5H2O和16 g/L KOH]，1 mL/L冰醋酸，取對數(shù)生長期的萊茵衣藻接種后在溫度為25 ℃，3000 lux的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.3 豬糞廢水預處理

畜禽豬糞廢水取自華中農業(yè)大學養(yǎng)豬場.取適量的水稀釋豬糞廢水，靜置12 h沉淀，取上清，以10 g/L殼聚糖為絮凝劑(體積比6%)，10 g/L海藻酸鈉(體積比3%)為助凝劑進行絮凝處理后，上清液即為實驗所需的畜禽豬糞廢水，測定廢水各指標的范圍見表1.實驗時用自來水將其稀釋至COD初始濃度約為 1000 mg/L，并高溫滅菌，每組實驗使用同一批廢水.

表1 豬場廢水測定值

1.4 藻菌共生系統(tǒng)的構建

分別將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻液和菌液取出，8000 r/min離心5 min后，棄上清(避免培養(yǎng)基對水質測量的干擾)，用經(jīng)過稀釋的滅菌畜禽豬糞廢水重懸后，分別將萊茵衣藻 (8.75×106細胞/mL,體積比10%)和芽孢桿菌 (7.63×108細胞/mL, 體積比1%)接入滅菌的畜禽豬糞廢水中，光照40～50 μmol/m2·s，25 ℃，150 r/min搖床連續(xù)培養(yǎng)5 d，取10 mL培養(yǎng)液8000 r/min離心5 min后，取上清作為樣品進行水質檢測.

1.5 水質的測定

1.5.1 COD試劑盒法測定

將COD試劑A、COD試劑B和水樣按照量程內的試劑比例加入到COD消解管中，水樣為樣品經(jīng)過6000 r/min離心10 min后的上清液，移取上清液3 mL于消解管中，消解裝置中加熱到140 ℃消解2 h后，自然冷卻到室溫，將COD消解管放入水質分析儀中測量水樣中COD 含量.

1.5.2 NH3-N,TN,TP含量的測定

將樣品 6000 r/min，離心10 min后，取上清液進行NH3-N,TN, TP含量的測定.監(jiān)測方法依照水質測定國家標準方法：水質總氮的測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法，GB/T 11894—1989；水中氨態(tài)氮采用標準測試方法，ASTM D1426—2003；水質總磷的測定采用鉬酸銨分光光度法，GB/T 11893—1989.

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均進行至少3次平行實驗，結果數(shù)據(jù)使用GraphPad prism 5.1分析軟件分析樣本的差異顯著性，采用One way-ANONA分析.

2 結果與分析

2.1 適宜在豬糞廢水中生長的芽孢桿菌的篩選

14株芽孢桿菌均為中南民族大學生物工程課題組篩選的益生菌.將14株芽孢桿菌培養(yǎng)于初始COD濃度 1000 mg/L畜禽豬糞廢水中，24 h后以豬糞廢水做參比，測得600 nm處的濁度如表2所示，得到生長較為明顯的有蠟樣芽胞桿菌B.cereusYS，凝結芽孢桿菌B.coagulansBS32，蠟樣芽胞桿菌B.cereusSLK和短小芽孢桿菌B.pumilusBSK9，但濁度值僅為0.4～0.5，說明芽孢桿菌對豬糞廢水中復雜有機物的同化能力有限.篩選這4株菌為后續(xù)實驗對象，與C.reinhardtiiCC-125構成藻菌共生系統(tǒng)，研究這4個系統(tǒng)對畜禽豬糞廢水中NH3-N, TN, TP, COD的去除效率.

表2 豬糞廢水中芽孢桿菌的濁度

2.2 藻菌共生系統(tǒng)對豬糞廢水水質的去除效果

圖1為4個藻菌共生系統(tǒng)在高濃度畜禽豬糞廢水中各指標的去除效率，以純藻系統(tǒng)作為對照.圖1a顯示3個藻菌共生系統(tǒng)對NH3-N的去除效率的提升并不顯著，而凝結芽孢桿菌B.coagulansBS32和C.reinhardtiiCC-125共生系統(tǒng)對NH3-N的去除效率比純藻系統(tǒng)降低了16.07% ；圖1b中B.coagulansBS32與C.reinhardtiiCC-125共生系統(tǒng)對TN的去除效果顯著(P<0.01)，比純藻系統(tǒng)提高了22.66%，而其他三組系統(tǒng)對TN的去除較差；圖1c顯示4個藻菌共生系統(tǒng)與純藻系統(tǒng)相比，對TP的去除效果均降低約20%；圖1d中 4株藻菌共生系統(tǒng)對COD的去除有促進，但未表現(xiàn)出顯著的去除效果.綜上所述，藻菌共生系統(tǒng)對初始COD濃度1000 mg/L的畜禽豬糞廢水中對各指標的去除效率并未表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢.

1)CC-125; 2)CC-125 with YS; 3)CC-125 with SLK; 4)CC-125 with BSK9; 5)CC-125 with BS32與純藻系統(tǒng)相比, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

2.3 添加葡萄糖藻菌共生系統(tǒng)對豬糞廢水的去除效果

與純藻系統(tǒng)相比，芽孢桿菌與萊茵衣藻共生系統(tǒng)未表現(xiàn)出對畜禽豬糞廢水凈化的優(yōu)勢，是由于芽孢桿菌在豬糞廢水中的生長受限.在豬糞廢水中添加0.5 g/L葡萄糖促進芽孢桿菌在處理過程中的生長，以積累菌體并發(fā)揮芽孢桿菌分解復雜污染物的作用，結果見圖2.圖2a中，添加0.5 g/L葡萄糖顯著提高了NH3-N去除效率(P<0.001)，藻菌共生系統(tǒng)對NH3-N去除效率均有不同程度的提高，其中B.cereusYS和C.reinhardtii共生系統(tǒng)對NH3-N去除效果最顯著，去除效率提高了19.63%；圖2b顯示所有藻菌共生系統(tǒng)與純藻系統(tǒng)相比，對TN的去除效率均有不同程度的提高，其中B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系統(tǒng)對TN的去除效率提高最為明顯，提高了28.4%；圖3c顯示各共生系統(tǒng)對TP的去除效果相較于純萊茵衣藻均有提高，約為10%；圖3c為COD的去除效率，添加葡萄糖后藻菌共生系統(tǒng)顯著提高(P<0.001)，其中B.coagulansBS32及B.cereusYS分別和C.reinhardtii組成的共生系統(tǒng)對COD的去除效率的提高均達到20%以上.綜上添加0.5 g/L葡萄糖顯著促進了廢水污染的去除效果，其中B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系統(tǒng)各指標的去除效率提高最為顯著，添加少量葡萄糖有效促進了藻菌共生系統(tǒng)對畜禽豬糞廢水的凈化.

2.4 藻菌共生系統(tǒng)添加葡萄糖和丙氨酸處理豬糞廢水

芽孢桿菌在營養(yǎng)不充足的情況下會形成芽孢進入休眠，而L-丙氨酸具有促進芽孢的萌發(fā)[14]，實驗同時添加少量丙氨酸和葡萄糖到豬糞廢水中，藻菌共生系統(tǒng)對畜禽豬糞廢水的處理效果結果見圖4.由圖4可見：與相同條件下的純藻系統(tǒng)相比，各共生系統(tǒng)較純萊茵衣藻對NH3-N去除效率增長了約18%；B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系統(tǒng)對TN的去除效率較顯著(P<0.001)，較純萊茵衣藻去除效率顯著提高了39.5%；藻菌共生系統(tǒng)對TP去除效率也顯著提高(P<0.001)，其中B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系統(tǒng)提高最顯著，較純萊茵衣藻提高了19.84%；各共生系統(tǒng)對COD去除效率提高顯著，均達到約80%，但4個系統(tǒng)對COD的去除效率差異并不明顯.綜上，同時添加丙氨酸和葡萄糖較單獨添加葡萄糖對廢水污染的去除效率顯著提高.其中B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系統(tǒng)各指標的去除效率提高最為顯著，說明微量丙氨酸和葡萄糖可顯著促進廢水中污染物的去除效率.

1)CC-125; 2)CC-125 with YS; 3)CC-125 with SLK; 4)CC-125 with BSK9; 5)CC-125 with BS32與純藻系統(tǒng)相比, ***P<0.01

1)CC-125; 2)CC-125 with YS; 3)CC-125 with SLK; 4)CC-125 with BSK9; 5)CC-125 with BS32與純藻系統(tǒng)相比, **P<0.01, ***P<0.001

3 結語

本文篩選出4株能夠在豬糞廢水中生長的芽孢桿菌(BacilluscereusYS,BacilluscereusSLK,BacilluspumilusBSK9,BacilluscoagulansBS32),并分別與C.reinhardtiiCC-125構成藻菌共生系統(tǒng)對豬糞廢水進行處理.在原始豬糞廢水中 4個藻菌共生系統(tǒng)對NH3-N, TN, TP, COD的去除效率未表現(xiàn)出優(yōu)勢；添加0.5 g/L葡萄糖后，藻菌共生系統(tǒng)的凈化效果均優(yōu)于純藻系統(tǒng)，B.coagulansBS32和C.reinhardtiiCC-125共生系統(tǒng)的去除效率提高最為顯著，對NH3-N, TN, TP, COD的去除效率較純藻系統(tǒng)相比分別提升了16.58%, 28.38%, 8.90%, 23.04%.豬糞廢水中同時添加0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L丙氨酸后，4個藻菌共生系統(tǒng)對污染物質的去除效率進一步提高，其中B.coagulansBS32和C.reinhardtiiCC-125共生系統(tǒng)的去除效果提升較顯著，對NH3-N, TN, TP, COD的去除效率較純藻系統(tǒng)分別提升了18.16%, 39.51%, 19.84%和39.56%，故添加葡萄糖和丙氨酸可以有效促進藻菌發(fā)揮協(xié)同作用，提高對豬糞廢水的處理效率，有助于藻菌共生系統(tǒng)對畜禽豬糞廢水的凈化.