郭春鳳 趙駿達 馬俊旗

[摘要] 目的 探討極性蛋白Par3（Par3蛋白）在慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ（CINⅡ～Ⅲ）、宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）以及轉移淋巴結組織中的表達及臨床意義。 方法 選擇新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦科2016年1月～2017年12月收治的CINⅡ～Ⅲ、CSCC以及因良性疾病行子宮切除術患者宮頸組織標本存檔石蠟包埋組織共93例，其中慢性宮頸炎14例、CINⅡ～Ⅲ36例、CSCC 43例。另CSCC淋巴結轉移灶組織標本7例。應用免疫組織化學染色法檢測極性蛋白Par3在上述組織中的表達。 結果 Par3蛋白在慢性宮頸炎、CINⅡ～Ⅲ、CSCC和轉移淋巴結組織中的陽性表達率分別為100.0%（14/14）、97.2%（35/36）、62.8%（27/43）、0，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。CSCC中高分化組Par3蛋白100%（7/7）表達，而中低分化組的表達下調為55.6%（20/36），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;根據(jù)是否發(fā)生淋巴結轉移分組（淋巴結轉移組7例;未發(fā)生淋巴結轉移組36例），Par3蛋白在淋巴結轉移組宮頸組織中陽性表達率是28.6%（2/7），而非轉移組為58.3%（21/36），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。Par3蛋白的低表達與組織學分化和發(fā)生淋巴結轉移有關，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 極性蛋白Par3在慢性宮頸炎、CINⅡ～Ⅲ以及CSCC、淋巴結轉移灶組織中的表達有差異，CSCC組織中表達下調，其異常低表達與CSCC發(fā)生發(fā)展有關，可以作為判斷宮頸上皮內瘤變發(fā)展為CSCC預警指標以及判斷CSCC惡性程度和預后的指標。

[關鍵詞] 宮頸腫瘤;Par3蛋白;蛋白表達;宮頸上皮內瘤變

[中圖分類號] R737.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（c）-0093-04

Expression of polar protein Par3 in cervical squamous cell carcinoma and its clinical significance

GUO Chunfeng? ?ZHAO Junda? ?MA Junqi

Department of Gynecology， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi? ?830011， China

[Abstract] Objective To explore the polarity protein Par3 （Par3 protein） in chronic cervicitis， cervical intraepithelial neoplasia Ⅱ-Ⅲ （CINⅡ-Ⅲ）， cervical squamous cell carcinoma （CSCC） and the expression differences in metastasis lymph node tissue and its clinical significance. Methods? From January 2016 to December 2017， Xinjiang Medical University First Affiliated Hospital of CINⅡ-Ⅲ CSCC， as well as the line of hysterectomy for benign disease patients with cervical tissue samples archived paraffin embedding tissue， a total of 93 cases were seleeted from Department of Gynaecology. Among them 14 cases of chronic cervicitis， 36 cases of CINⅡ-Ⅲ， and 43 cases of cervical squamous cell carcinoma. Another 7 cases of cervical squamous cell carcinoma lymph node metastasis tissue samples. The expression of polar protein Par3 in the above tissues was detected by immunohistochemical staining. Results The positive expression rate of Par3 protein in chronic cervicitis， CINⅡ-Ⅲ， CSCC and metastasis lymph node tissues were 100.0% （14/14）， 97.2% （35/36）， 62.8% （27/43）， 0 respectively， the differences between each group had statistical significance （P < 0.05）. The Par3 protein expression was 100% （7/7） in the high differentiation group of CSCC， while the expression was down-regulated to 55.6% （20/36） in the low and medium differentiation group， with statistically significant difference （P < 0.05）. They were grouped according to whether lymph node metastasis had occurred （7 cases in lymph node metastasis group 36 cases in the group without lymph node metastasis. The positive expression rate of Par3 protein in cervical tissues of the lymph node metastasis group was 28.6% （2/7）， while that of the non-metastasis group was 58.3% （21/36）， with statistically significant difference （P < 0.05）. The low expression of Par3 protein was correlated with histological differentiation and lymph node metastasis， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Polarity protein Par3 in chronic cervicitis， CINⅡ-Ⅲ CSCC and are differentially expressed， the expression of CSCC is down-regulated， and its abnormal low expression is related to the occurrence and development of CSCC， which can be used as an early warning indicator to judge the development of cervical intraepithelial neoplasia into CSCC， as well as an indicator to judge the malignancy degree and prognosis of CSCC.

[Key words] Uterine cervical neoplasms; Par3; Protein expression; Cervical intraepithelial neoplasia

近年來，我國宮頸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，流行病學調查表明，發(fā)病率可達（274～483）/10萬[1]。宮頸癌侵襲轉移率高是該病病死率高的主要原因，晚期宮頸癌患者治療的效果和預后很差，5年生存率也較低[2]。目前，研究[3]證明腫瘤細胞發(fā)生侵襲遷移，極性蛋白異常的表達（缺失或上調）被視為最為關鍵的原因。細胞間相互連接作用減弱，腫瘤細胞極性發(fā)生紊亂，細胞間黏連減弱或丟失，細胞骨架遭到破壞并重構，細胞獲得了間質細胞形態(tài)和特性，引發(fā)上皮-間質轉變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。這其中極性蛋白復合物Par3-Par6-aPKC在上皮腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮著重要的功能，Par3是復合物中的最為關鍵組分[4]。研究[5-7]證實極性蛋白Par3在乳腺癌、原發(fā)性食管癌及胰腺癌中低表達;且與腫瘤的低分化、轉移及總生存期相關。但是在肝癌、前列腺癌及腎透明細胞癌等組織中，Par3蛋白陽性表達率卻高于正常組織，且與患者低生存率正相關[8-9]。因Par3蛋白在宮頸鱗癌中的表達研究甚少，故采用免疫組織化學方法測定慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ（CINⅡ～Ⅲ）以及宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）、淋巴結轉移灶組織中Par3蛋白的表達，分析其與臨床病理參數(shù)的關系，探討Par3蛋白在CSCC的發(fā)生、發(fā)展和轉移中的作用機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2016年1月～2017年12月慢性宮頸炎、CINⅡ～Ⅲ和CSCC患者的石蠟包埋組織93例，另7例CSCC患者淋巴結轉移灶組織標本。其中慢性宮頸炎14例，CINⅡ～Ⅲ36例，CSCC 43例（按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2009年的標準進行分期：≤ⅠB 16例，>ⅡA 27例。病理分級：高分化鱗癌7例，中低分化鱗癌36例）。所有標本經(jīng)我院病理科2位副主任醫(yī)師復審確診。本研究獲我院醫(yī)學倫理委員會批準，標本提供者均知情同意。

納入標準：經(jīng)病理組織活檢確診為CSCC、CINⅡ～Ⅲ以及慢性宮頸炎患者。

排除標準：①合并其他惡性腫瘤者;②妊娠期及哺乳期患者;③宮頸癌診斷不明確者④宮頸鱗癌術前應用放療、化療者或免疫治療者;⑤臨床病例資料不完整者。

1.2 抗體和試劑

SP試劑盒及DAB顯色劑均購買自北京中杉金橋公司。鼠抗人Pard3抗體（1∶300稀釋，Santa Cruz公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化SP法檢測不同組織中Pard3蛋白表達? 切片采用常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，再用微波爐進行抗原修復，加入適量的H2O2阻斷內源性過氧化物酶，最后加入一抗，置入4℃冰箱過夜（磷酸鹽緩沖溶液（PBS）作陰性對照。第2天再加二抗（各步間隔PBS緩沖液沖洗10 min）。用DAB顯色，蘇木精復染后再常規(guī)脫水、透明封片待用。

1.3.2 結果判斷? 選擇2位病理科副主任醫(yī)師，采取雙盲法判讀免疫組化的結果，采用陽性細胞數(shù)計數(shù)和染色程度綜合判斷表達結果。在光學顯微鏡下（200×）觀察全視野的細胞，并且計數(shù)陽性細胞數(shù)所占上皮細胞的比例。根據(jù)所占比例判讀記分，陽性細胞數(shù)<5%記0分，5%～25%記1分，>25%～75%記2分;>75%記3分。染色強度判定：完全不顯色或顯色不明顯為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色視為3分。綜合積分=（染色細胞分數(shù)+染色強度分數(shù)）/2。綜合判定：如積分<0.5分則為表達缺失，0.5～1.5分為表達下調，積分>1.5分視為正常表達[10]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗以及Fisher精確概率法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Par3蛋白在慢性宮頸炎、CINⅡ～Ⅲ、CSCC以及轉移淋巴結組織中的表達

與慢性宮頸炎組織比較，CINⅡ～Ⅲ和CSCC組織中Par3陽性表達率明顯減少，轉移淋巴結組織中表達缺失，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。免疫組織化學檢測結果顯示，Par3陽性表達主要定位在細胞質，陽性細胞染色呈深黃色或棕黃色。見圖1（封四）。

2.2 CSCC組織中Par3蛋白陽性表達與臨床病理參數(shù)的關聯(lián)性分析

Par3蛋白的陽性表達量與CSCC的組織學分化相關，高分化宮頸癌組織中陽性表達率高于中低分化宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。Par3蛋白在淋巴結轉移宮頸癌組織中的表達低于淋巴結未轉移組宮頸組織，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

研究[11-12]指出，在哺乳動物的上皮細胞頂端側膜上存在Par3-Par6-a PKC聚合體定位，其主要作用是保持上皮細胞緊密連接（tight junction，TJ），維持細胞的正常極性，在TJ形成時，極性蛋白Par3承擔錨定蛋白及腳手架蛋白的作用，招募Par6或aPKC蛋白共同定位。研究[11，13]證實Par3蛋白過表達或缺失都會破壞TJ，同時Par6、aPKC和TJ蛋白也會定位錯誤，Par3蛋白的骨架作用被破壞，細胞極性丟失。伴隨Par3表達或定位錯誤，許多生長類因子異常滲入通過自分泌或旁分泌形成了腫瘤微環(huán)境，誘導上皮細胞發(fā)生腫瘤化[14]。

Bilder[15]將果蠅設計成模型，研究使細胞極性丟失，上皮細胞的增殖會失調，從而促進腫瘤的形成。研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，Par復合體主要表達于細胞之間的TJ處，aPKC與Par3/Par6的相互作用是細胞極性發(fā)生的關鍵因素，復合體的穩(wěn)定性主要由Par3承擔。一旦Par3丟失或定位錯誤，細胞將發(fā)生增殖失調。許多有關上皮腫瘤的研究也證實了極性蛋白是眾多腫瘤調控因子之一，各種原因導致的丟失或錯誤定位誘導上皮細胞增殖失調，促進乳腺癌、前列腺癌等的發(fā)生，甚至在腫瘤細胞侵襲轉移過程當中也起到尤為關鍵的作用。故對于上皮腫瘤的早期判斷指標將細胞的極性丟失以及組織架構紊亂列為首要標準。目前，人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的熱點研究逐漸聚焦極性蛋白的始動因素，其中大多數(shù)集中在乳腺癌和消化道腫瘤領域。本研究通過檢測慢性宮頸炎、CINⅡ～Ⅲ以及CSCC和轉移淋巴結組織中Par3蛋白的表達水平，分析蛋白水平表達差異與CSCC發(fā)生是否有關，以及其與CSCC病理參數(shù)的關系。

Mescher等[18]一項有關惡性黑色素瘤研究顯示，表皮極性蛋白Par3低表達促進惡性黑色素瘤細胞的分化、運動和增殖，在自體黑色素瘤模型中，導致腫瘤形成并增加肺轉移率。Par3低表達或缺失可以上調表皮P-cadherin，這對促進黑色素瘤細胞增殖和表型分化至關重要。即上皮低表達Par3和高P-cadherin表達與人類黑色素瘤進展相關，且后者與黑色素瘤患者生存期降低相關。鱗癌組織中的Par3較正常組織明顯低表達，低表達的Par3與腫瘤淋巴結轉移和低分化腫瘤相關[6]。本研究結果與之相同。胰腺癌組織中發(fā)現(xiàn)，在Par3/Par6/aPKC復合物中僅Par3蛋白低表達，Par3蛋白高表達的患者總生存期長于低表達組[7]。Par3蛋白表達升高與前列腺癌轉移呈正相關。Par3的下調在體外抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲，在體內抑制腫瘤的轉移，而過表達Par3則產(chǎn)生相反的結果。在卵巢癌中Par3表達也是升高的，其機制是通過調控IL6/STAT3通路促進卵巢癌的發(fā)生及轉移[19]。由此可見，Par3蛋白表達可能與腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤分類相關，不同腫瘤組織中其表達也或高或低，其促癌或抑癌的作用機制尚需進一步探究。

本研究中Par3蛋白在慢性宮頸炎組織中陽性表達率為100.0%，CINⅡ～Ⅲ、CSCC以及轉移淋巴結組織中分別為97.2%、62.8%、0.0%。在宮頸疾病由宮頸炎癥、CIN發(fā)展至CSCC，甚至盆腔淋巴結轉移的疾病進程中，Par3蛋白的陽性表達率逐漸降低。CSCC組織中低表達，而轉移淋巴結組織中甚至是表達缺失。因此，我們可以將Par3蛋白表達下調視為細胞間變或者發(fā)生惡性變的早期預警信號。對Par3表達水平與CSCC的臨床病理參數(shù)的關聯(lián)性進行分析，顯示Par3的陽性表達率與腫瘤的組織學分化及淋巴結轉移有關。Par3蛋白低表達，細胞之間的黏連遭到破壞、同時細胞極性丟失，細胞之間連接松散細胞分化發(fā)生改變，直至細胞異常增殖惡性變。由此推測Par3蛋白是作為CSCC的抑制因子參與疾病發(fā)生發(fā)展，同時可能與CSCC組織學分化以及淋巴結轉移有關，也可視為CSCC術后預后不良的重要因素之一。本研究7例轉移淋巴結組織中Par3蛋白表達缺失，推測Par3蛋白低表達甚至表達缺失可能與腫瘤侵襲及淋巴結轉移有關。故臨床中Par3蛋白低表達甚至表達缺失，提示腫瘤的細胞惡變程度和淋巴結轉移的可能性大。Zheng等[20]也認為CSCC的發(fā)生與Par3蛋白的表達降低有關。Par3蛋白表達缺失促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進遷移和侵襲。Par3的缺失導致SiHa細胞中MMP9的表達和EMT相關基因（N-cadherin、E-cadherin、a-catenin）表達的改變。認為Par3蛋白低表達可以作為宮頸癌患者預后不良的標志，其機制可能是通過增強EMT促進腫瘤的發(fā)生[19]。本研究因納入樣本量少，尚需進一步擴大樣本量研究轉移淋巴結組織中Par3蛋白表達與CSCC不良預后的相關性。Par3蛋白作為眾多極性蛋白之一，與其他極性蛋白以及下游通道之間一定存在相互調節(jié)、誘導甚至拮抗作用，從而促使腫瘤微環(huán)境形成。

Par3蛋白作為多個極性蛋白家族成員之一，可調控細胞極性，在多種腫瘤中Par3蛋白異常表達。本研究得出Par3蛋白在CSCC組織中低表達，并與腫瘤的組織學分化及淋巴結轉移有關。推測Par3蛋白低表達與CSCC發(fā)生有關，并在腫瘤的組織學分化、侵襲轉移中有重要的作用。但因本研究僅為組織學的蛋白表達研究，進一步需設計細胞和動物水平的研究，探究極性蛋白Par3低表達在CSCC發(fā)生發(fā)展的機制，希望豐富CSCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移的實驗依據(jù)。

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