劉 丹， 李然紅， 陳 鑫， 王立鳳

(牡丹江師范學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157012)

黃酮類化合物是多酚類次生代謝物，在植物體中主要參與植物的生長(zhǎng)繁殖、花色形成、抗病性及非生物環(huán)境脅迫等生理作用，具有抗氧化、消除自由基等功效。查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase,CHI)是黃酮類代謝途徑中關(guān)鍵酶，在黃酮代謝調(diào)控方面起重要作用。1987 年，CHI基因首次從法國(guó)豌豆中分離出來，隨后在玉米、豌豆、菜豆等多種植物中克隆分離到該基因[1-3]。CHI基因?yàn)槎囝愋图易?，根?jù)特異性分為TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ、TypeⅣ共4種類型[4]，許多植物中同時(shí)存在多種類型的CHI基因，如甘草中有2種類型CHI基因，豆科植物百脈根植物中存在3種CHI基因[5-6]。作為黃酮類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，CHI基因能夠調(diào)控查爾酮的積累，進(jìn)而影響其黃酮類化合物的含量，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、花葉變色、抵抗性等方面作用顯著。BEDBAR等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CHI基因能夠影響矮牽牛查爾酮的積累，改變矮牽牛花粉的顏色；同時(shí)大麥和洋蔥CHI基因失活導(dǎo)致黃酮類化合物的含量急劇下降，而過量表達(dá)CHI基因則含量顯著提高[8]。狗棗獼猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.& Rupr.) Maxim.〕別名狗棗子，是獼猴桃科(Actinidiacese)獼猴桃屬(Actinidia)落葉藤本植物，是最為耐寒的獼猴桃種類之一[9]。目前關(guān)于狗棗獼猴桃的研究主要集中在有效物質(zhì)提取、營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥價(jià)值開發(fā)及繁殖技術(shù)上，有關(guān)其抗性基因的研究尚少。因此，以狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，篩選到狗棗獼猴桃查爾酮異構(gòu)酶AkCHI1的cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，以期為AkCHI1功能研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

狗棗獼猴桃AkCHI1 cDNA序列從牡丹江師范學(xué)院植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得；中華獼猴桃變種(PSR86069.1Actinidiachinensisvar.chinensis)、茶樹(XP_028087110.1Camelliasinensis)；芝麻(XP_011079862.1Sesamumindicum)、黑穗槐(XP_021279652.1Herraniaumbratica)、可可樹(XP_017977137.1Theobromacacao)、葡萄(CBI28694.3Vitisvinifera)、歐洲橄欖(XP_022864712.1Oleaeuropaeavar.sylvestris)、東方苔草(PON84200.1Tremaorientale)、蘋果(XP_008368846.1Malusdomestica)；山黃麻(PON55262.1Parasponiaandersonii)、番木瓜(XP_021898058.1Caricapapaya)、紫花風(fēng)鈴(PIN18250.1Handroanthusimpetiginosus)、核桃(XP_018856033.1Juglansregia)、榴蓮(XP_022771113.1Duriozibethinus)、馬鈴薯(XP_006352775.1Solanumtuberosum)、美女煙草(XP_009803839.1Nicotianasylvestris)、番茄(XP_004242334.1Solanumlycopersicum)等植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。

1.2 方法

AkCHI1的理化性質(zhì)用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)進(jìn)行分析；NCBI-CDD進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域及蛋白家族預(yù)測(cè)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/ search/sequence-search)預(yù)測(cè)功能位點(diǎn)；NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)對(duì)N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)對(duì)O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用 PredictProtein 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.predictprotein.org/)對(duì)AkCHI1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得18條不同植物的氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹。

同時(shí)，還要大量增加新質(zhì)專業(yè)力量，依托信息產(chǎn)業(yè)、地質(zhì)測(cè)繪、航空航天、交通運(yùn)輸、裝備制造等行業(yè)部門，編建戰(zhàn)略投送、遠(yuǎn)程預(yù)警、信息通信、網(wǎng)絡(luò)攻防、海上救援、高技術(shù)裝備技術(shù)保障等新質(zhì)力量，適應(yīng)支援保障打贏信息化戰(zhàn)爭(zhēng)的需要。

2 結(jié)果與分析

2.1 AkCHI1的理化性質(zhì)

對(duì)AkCHI1氨基酸序列分析表明，狗棗獼猴桃AkCHI1基因cDNA全長(zhǎng)為1 168 bp，編碼區(qū)(CDS)為cDNA上第81～941個(gè)堿基，共編碼287個(gè)氨基酸，分子量31 610.03 D，理論等電點(diǎn)為9.30，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為33，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為41，分子式為C1386H2242N402O424S9，總原子數(shù)4 463，親水性(GRAVY)的平均水平為-0.237。不穩(wěn)定指數(shù)為55.60，說明該蛋白非穩(wěn)定。由圖1可見，該蛋白中含量最多的為絲氨酸，占11.5%，其次為亮氨酸和精氨酸，各占9.8和8.4%，含量最少的為色氨酸，為0.3%。經(jīng)預(yù)測(cè)(圖2)，該基因蛋白的整個(gè)肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分的最大值為2.122，在36個(gè)氨基酸處；最小值為-2.511，在24個(gè)氨基酸處。蛋白質(zhì)存在3個(gè)高分值(>2)，6個(gè)低分值(<-2)，根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白。

圖1 AkCHI1基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkCHI1 gene

圖2 AkCHI1蛋白的親水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkCHI1

2.2 AkCHI1的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)

滴滴的企業(yè)使命宣稱是“讓出行更美好”，而滴滴似乎卻一直沉浸在商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)的慣性思維中，忽視了自身所帶有的公共屬性，并任憑自身壟斷性的優(yōu)勢(shì)，一次次危害公共利益。在出行這件事上，最重要的始終是安全問題，但愿滴滴能通過這些血淋淋的生命教訓(xùn)，真正把乘客安全問題重視起來，及時(shí)有效地對(duì)平臺(tái)內(nèi)部進(jìn)行整改，而不是每次事件發(fā)生后換來的一篇不痛不癢的道歉信。

注：C值、S值和Y值分別是原始剪切位點(diǎn)、信號(hào)肽和綜合剪切位點(diǎn)的分值。

Note: The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

圖3 AkCHI1蛋白的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)

Fig.3 Signal peptide and transmembranne domain of AkCHI1

2.3 AkCHI1功能位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域

由表1可見，AkCHI1上含有8個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)十四烷酰化位點(diǎn)。對(duì)N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)表明，該蛋白內(nèi)有1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，在67(NRSS)氨基酸處。O-糖基化是另一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，O-糖鏈能維持所連接蛋白質(zhì)部分的空間構(gòu)象，NetOGlyc4.0 server對(duì)O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)均大于0.5的認(rèn)為是陽(yáng)性，故推測(cè)該蛋白內(nèi)共含11個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。

2.4 AkCHI1的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)

對(duì)AkCHI1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，組成AkCHI1的287個(gè)氨基酸中，42.51%的氨基酸可能會(huì)形成螺旋，19.86%的氨基酸可能形成延伸鏈，3.14%的氨基酸可能形成轉(zhuǎn)角，34.49%的氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲，無二硫鍵和特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)AkCHI1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖5)，該結(jié)構(gòu)主要由螺旋和無規(guī)則卷曲組成，在第82～283個(gè)氨基酸組成的三級(jí)結(jié)構(gòu)，含有查爾酮異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域。

經(jīng)預(yù)測(cè)(圖3)，AkCHI1蛋白不含信號(hào)肽，D值為0.196(<0.450)，不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

圖4 AkCHI1蛋白的保守序列

圖5 AkCHI1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

Fig.5 Tertiary structure prediction of AkCHI1 protein

2.5 AkCHI1的蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)

對(duì)AkCHI1保守序列及蛋白家族預(yù)測(cè)表明，AkCHI1同時(shí)具有Chalcone2、Chalcone3的保守序列，是Chalcone3(PLN03174)家族的一員(圖4)。

2.6 AkCHI1的氨基酸序列同源性

AkCHI1氨基酸序列與18種植物的CHI氨基酸序列進(jìn)行同源性分析表明(圖6)，狗棗獼猴桃與榴蓮的親緣關(guān)系較近，而與葡萄等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2009年新修訂的《歐盟排放交易指令》對(duì)2012年年底之前注冊(cè)的項(xiàng)目從2013年起產(chǎn)生的CERs作了詳細(xì)說明，在未達(dá)成有法律效力的國(guó)際減排協(xié)議的情況下，歐盟各成員國(guó)至少在2015年5月31日前有權(quán)利但非義務(wù)使用特定項(xiàng)目類型的CERs。歐盟氣候委員會(huì)于2011年1月21日通過的草案明確規(guī)定，2013年1月1日起 EU—ETS不得使用來自HFC23項(xiàng)目和己二酸N2O項(xiàng)目產(chǎn)生的 CERs，2013年前產(chǎn)生的 CERs可以使用到2013年4月30日。

表1 AkCHI1蛋白的修飾位點(diǎn)

圖6 CHI1的蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.6 System phylogenetic tree of CHI1

3 結(jié)論

CHI基因具有調(diào)節(jié)植物組織顏色及調(diào)控類黃酮生物合成的主要功能，在番茄等植物中分析得到，CHI基因能夠控制花瓣、果皮等組織的顏色，并在黃酮類物質(zhì)代謝中是關(guān)鍵酶類[1]。因此，分析篩選AkCHI1基因cDNA序列信息，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究狗棗獼猴桃花葉及黃酮類物質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。結(jié)果表明，AkCHI1基因cDNA總長(zhǎng)1 168 bp，CDS為861 bp，編碼的蛋白由287個(gè)氨基酸構(gòu)成。具有Chalcone2、Chalcone3的保守序列，是Chalcone3(PLN03174)超家族的一員，為親水性非穩(wěn)定的蛋白。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST，與AkCHI1相比的100條CHI基因的氨基酸序列中，一致性最高的達(dá)到96.04%，最低的也為57.67%，說明在不同的植物中，CHI基因的氨基酸序列十分保守。選取18條氨基酸序列與AkCHI1進(jìn)行比對(duì)表明，狗棗獼猴桃與榴蓮的親緣關(guān)系較近，而與葡萄等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。