胡 毅， 王 微， 劉文鋒， 鄢人雨， 何 潔， 潘承丹

(1.黔東南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心， 貴州 凱里 556000; 2.貴州大學， 貴州 貴陽 550001)

我國茶文化博大精深，源遠流長，茶葉種類眾多[1]。按照成品茶葉形狀分類可分為卷曲形茶、扁形茶、針形茶、磚茶、條形茶、珠茶以及球形茶等[2-3]。不同類型茶葉的產(chǎn)地較多，但是球形茶目前就只有雷山銀球茶[4]。雷山銀球茶在1982年由毛克翕先生研制而成[5]，是貴州省雷山縣特產(chǎn)，中國國家地理標志產(chǎn)品。雷山銀球茶是全國獨一無二的特型茶，加工技術(shù)獲多項國家專利[6]，其表面銀灰墨綠，含硒量高達2.00～2.02 μg/g，是一般茶葉平均含硒量的15倍左右，其利用高山茶葉果膠豐富特點，不加任何添加劑，手工制成一種不同于坨茶、磚茶的球狀茶，沖4～5次水余香猶濃，茶水微黃清澈，飲之醇香而微甜。茶葉的質(zhì)量主要涵蓋三部分，即感官指標、理化指標和衛(wèi)生指標。茶葉品質(zhì)通過感官審評來進行，具有一定的局限性，尤其是對我國國家地理標志保護的原產(chǎn)地茶和各種名茶，說服力不足，不能全面客觀地反映茶葉的品質(zhì)[7-8]。指紋圖譜是一種綜合、可量化的質(zhì)量控制手段，近年來在茶葉品質(zhì)鑒定、真?zhèn)舞b別、品種和產(chǎn)地識別等方面的應(yīng)用越來越廣泛[9-12]。由于產(chǎn)地偏遠、知名度較弱，目前對雷山銀球茶的研究較少，對雷山銀球茶的鑒別缺乏有效的方法。雷山銀球做為綠茶與其他綠茶具有很高的相似度，不易區(qū)分。為此，筆者等應(yīng)用超高效液相色譜指紋圖譜法分析7個雷山銀球茶樣品，對雷山銀球茶中水溶性成分進行測定，并與其他綠茶進行對比分析，以期為雷山銀球茶的鑒別和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

茶葉樣品：7個雷山銀球茶(L1～L7)，取自雷山縣茶企業(yè)； 2個綠茶(Z1，Z2)取自其他茶企業(yè)。試驗采用的茶葉均為2018年生產(chǎn)，其生產(chǎn)信息見表1。

表1 茶葉樣品生產(chǎn)信息

儀器與設(shè)備：Waters超高效液相色譜儀[Waters PDA 檢測器，色譜柱Waters PEH C18，并配有Waters PEH C18預(yù)柱 沃特世科技(上海)有限公司]，數(shù)控超聲清洗機(上海冠特超聲波儀器有限公司)，分散機(德國IKA)，離心機(TG-16-WS 湖南湘儀)，電子天平(JY5002 上海舜宇恒平)，電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1檢測方法

1) 樣品前處理。稱取1.000 g粉碎茶樣(過40目篩網(wǎng))于100 mL錐形瓶中，加入90℃的超純水100 mL，立即放入90℃水浴中超聲提取20 min。提取完成后，靜置，冷卻至室溫，4 500 r/min離心5 min后取上層清液，過0.45 μm濾膜，待測。

2) 色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm×1.7 μm)，柱溫30℃，進樣量：2 μL。檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長210 nm。流動相：溶劑A，0.01%磷酸水溶液，溶劑B：乙腈。洗脫程序見表2。

表2 超高效液相色譜梯度洗脫程序

1.2.2精密度、準確度及空白試劑干擾性根據(jù)1.2.1檢測方法處理樣品6個重復(fù)并測定，得到6次重復(fù)的目標色譜峰保留時間和峰面積，分別計算其相對標準偏差(RSD)。

1.2.3指紋圖譜的構(gòu)建和相似度評價按照已建立的UPLC分析方法，對7個雷山銀球茶樣品進樣分析，將所提到的雷山銀球茶色譜圖CDF原始文件導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)，得到7個雷山銀球茶樣本的指紋圖譜，并進行相似度評價分析。

根據(jù)中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)分析，將各色譜峰的保留時間與同一圖譜中參照峰的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間；各色譜峰按相對保留時間一一匹配后，選擇 90% 以上樣本共有的峰為樣本集的共有峰[13-14]。

1.2.4水溶性成分分析按照 1.2.1中的方法進行所有茶葉樣品前處理得到上機液，再按 1.2.2 色譜條件，進樣2 μ L ，連續(xù)進樣 3 次，通過對照標準品比對，確定化合物。運用外標法根據(jù)峰面積平均值，計算各茶葉中已知成分的含量。

1.2.5主成分分析主成分分析是將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法[15]。運用SPSS分析軟件，將多維變量進行降維處理分析，選出最主要的可代表所分析問題的數(shù)據(jù)，從而使分析問題簡單化。在樣品已知成分定量分析的基礎(chǔ)上，將茶葉中所含的各化合物的含量作為變量，對雷山銀球茶樣品進行主成分分析。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)處理與標準曲線繪制采用 Excel 2007 進行分析，采用 SPSS 進行主成分聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1方法學考察

經(jīng)測定，6次重復(fù)的色譜峰保留時間和峰面積的RSD范圍分別是0.26%～1.59%和0.63%～3.12%，表明測定方法的精密度和準確度良好，試劑空白對試驗無干擾。

2.2雷山銀球茶指紋圖譜的構(gòu)建

從圖1可知，7個雷山銀球茶的色譜圖有27個共有峰。從表3可知，雷山銀球茶27個共有峰的平均相對保留時間為0.821～16.006min。 通過對照標準品比對，共確定12種化合物(圖2)，分別是表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(ECG)、表兒茶素沒食子酸酯(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素(GC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子酸(GA)、咖啡因(CAF)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、茶氨酸、兒茶素和茶堿。

圖1 雷山銀球茶 L1～L7樣品的指紋圖譜

注：峰2為茶氨酸，峰3為GA，峰6為GC，峰7為茶堿，峰9為EGC，峰11為兒茶素，峰12為CAF，峰18為EC，峰19為EGCG，峰21為GCG，峰25為ECG，峰26為CG，其余色譜峰未知。

Note: peak 2, theanine; peak 3, GA; peak 6, GC; peak 7, theophylline; peak 9, EGC; peak 11, catechin; peak 12, CAF; peak 18, EC; peak 19, EGCG; peak 21, GCG; peak 25, ECG; peak 26, CG. The remaining peaks are unknown.

圖2雷山銀球茶UPLC共有峰指紋圖譜

Fig.2 Common peaks from UPLC fingerprints of Leishan Yinqiu tea samples

表3 雷山銀球茶共有峰的平均相對保留時間

2.3雷山銀球茶UPLC指紋圖譜相似度評價

從表4可知，雷山7個銀球茶(L1～L7)與對照品指紋圖譜相似度(共有模式)在0.964～0.984，均值在0.96以上，相似度較高，可見雷山銀球茶的化學成分相似且穩(wěn)定[16]。2個綠茶(Z1，Z2)與對照品指紋圖譜的相似度分別是0.94和0.947，由于同屬于綠茶類，生產(chǎn)地也較接近，因此在共有模式下相似度也較高[17]。但是，Z1和Z2與L1～L7的相似度在0.861～0.903，可見，綠茶與雷山銀球茶的差別比較明顯。

表4 不同茶葉與雷山銀球茶UPLC指紋圖譜的相似度

2.4不同茶葉水溶性成分含量

從表5可知，L1～L7的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯含量分別是3.9～8.5 mg/g和5.0～8.1 mg/g ，較Z1和 Z2低(11.1～12.0 mg/g和13.9～15.1 mg/g)；L1～L7的茶氨酸為17.2～21.9 mg/g ，比Z1和Z2高(11.8 mg/g和10.3 mg/g)。因此，雷山銀球茶與綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯和茶氨酸差別較明顯，其余水溶性浸出物含量的差異較小。不同的原料、不同加工方式對茶葉的水溶性浸出物均有影響，由于產(chǎn)地較接近，又同屬于綠茶類，故綠茶(Z1，Z2)和雷山銀球茶(L1～L7)的部分水溶性浸出物較相似。

表5 不同茶葉水溶性成分含量

2.5雷山銀球茶主成分分析

從表6可知，共提取到2個主成分可以概括雷山銀球茶91.811%的成分含量信息。從主成分載荷矩陣(表7)可知，沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素、表沒食子兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、兒茶素沒食子酸酯在第一主成分上的載荷較大，即與第一主成分的相關(guān)系數(shù)均較高；其中沒食子兒茶素沒食子酸酯的載荷最高。其次，表兒茶素沒食子酸酯在第二主成分上的載荷絕對值較大，即負相關(guān)程度較高；同時茶氨酸在第二主成分上的載荷最大，即相關(guān)程度最高。可知，第一主成分為沒食子兒茶素沒食子酸酯，第二主成分為茶氨酸。

表6 雷山銀球茶主成分分析方差貢獻率

表7 雷山銀球茶水溶性成分的主成分載荷矩陣

3結(jié)論與討論

雷山銀球茶是貴州省雷山縣的特產(chǎn)，也是中國國家地理標志產(chǎn)品。超高效液相色譜法(UPLC)比HPLC法分離效率更高、分析速度更快、準確率更高，因此試驗應(yīng)用UPLC測定茶葉中的水溶性浸出物，并結(jié)合中藥指紋圖譜相似度評價方法構(gòu)建雷山銀球茶指紋圖譜，同時對雷山銀球茶及其他綠茶進行相似度評價。結(jié)果表明，雷山銀球茶擁有 27個共有峰，通過對照標準品比對，共確定12個化合物。雷山銀球茶的指紋圖譜與對照標準品的相似度(共有模式)在0.96以上；而另外2個生產(chǎn)地較接近的綠茶(Z1，Z2)與雷山銀球茶對比相似度在0.861～0.903；各樣品的水溶性浸出物中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯和茶氨酸的含量差異較明顯，其余指標區(qū)別較小。主成分得分分析表明，雷山銀球茶的第一主成分為沒食子兒茶素沒食子酸酯，第二主成分為茶氨酸。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從中國綠茶中提取的一種成份，它是綠茶主要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9%～13%[18]。茶氨酸為白色針狀體，易溶于水。具有甜味和鮮爽味，是茶葉的滋味的組分[19]。雷山銀球茶(L1-L7)的茶氨酸明顯比綠茶(Z1，Z2)高很多，所以雷山銀球茶口感較甘甜爽口。

綜上所述，運用UPLC法構(gòu)建雷山銀球茶的特征指紋圖譜，通過相似度、對照品定量分析、主成分分析等得到了較為理想的結(jié)果 ，對雷山銀球茶與其他綠茶的鑒別提供了數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù)。