張旭光，杜瑞琥，陳彥平，趙 艷*

(1．哈爾濱市兒童醫(yī)院兒童保健科，黑龍江哈爾濱 150010；2．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)，黑龍江 哈爾濱 150081；3．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

胃癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，臨床上治療胃癌的手段主要有手術(shù)與化療，但常規(guī)化療藥物副作用大，加之腫瘤細(xì)胞常對化療藥物產(chǎn)生耐藥，從而限制了化療藥物的臨床應(yīng)用[1]。維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的衍生物，VES對胃癌等多種腫瘤細(xì)胞均能表現(xiàn)出極強(qiáng)的殺傷作用，而對正常細(xì)胞卻無任何毒副作用。本課題組前期研究結(jié)果表明VES能夠通過激活酸性神經(jīng)磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASmase)作為起始因子來促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，其下游信號通路包含了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，但ASMase早期活化后其下游因子神經(jīng)酰胺的聚集情況還未明確[2]。此外，本課題組早期研究還發(fā)現(xiàn)VES能夠通過死亡受體信號通路、氧化應(yīng)激途徑促進(jìn)人胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，而ASMase與上述兩條信號通路之間的關(guān)系也尚未明確[3-4]。因此，本研究擬進(jìn)一步探討VES通過ASMase促進(jìn)人胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中神經(jīng)酰胺的聚集變化、死亡受體信號通路及氧化應(yīng)激反應(yīng)在這一過程中的作用，以進(jìn)一步明確VES在促進(jìn)人胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中各信號通路的上下游關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

低分化人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室保存。VES、ASMase抑制劑地昔帕明(desipramine，DES)與抗Cer抗體均購自美國Sigma公司，ASMase活性試劑盒購自美國Echelon Biosciences公司，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自美國Invitrogen公司；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)探針購自碧云天生物技術(shù)研究所；Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP多克隆抗體均購自美國Cell Signal公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人胃癌SGC-7901細(xì)胞在含有10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為溫度37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%。待其生長狀態(tài)良好后，用0.02%EDTA消化傳代，細(xì)胞鋪滿85%瓶底面積時，棄去原培養(yǎng)液，更換為2%RPMI-1640培養(yǎng)液并加受試物處理：VES組用20 μg/mL VES處理細(xì)胞；VES+DES組用12.5μmol/L DES預(yù)處理細(xì)胞2 h，再加20μg/mL VES處理細(xì)胞；陰性對照組用2%RPMI-1640培養(yǎng)液處理細(xì)胞；DES組用12.5μmol/L DES提前2 h處理細(xì)胞。分別在不同時間點(diǎn)檢測VES組和VES+DES組中ASMase和Cer的表達(dá)情況來確定兩者表達(dá)高峰的出現(xiàn)時間和DES對兩者的抑制作用。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，選擇VES作用后細(xì)胞發(fā)生凋亡最明顯的時間點(diǎn)(24 h)檢測4組細(xì)胞的凋亡率、死亡受體信號通路蛋白表達(dá)和氧化應(yīng)激情況。

1.2.2 ASMase活性檢測 收集VES組、VES+DES組0、1.5、3、6 h的細(xì)胞各1.5×106個，超聲裂解后取上清液20μL(含20μg蛋白)分別置于96孔板內(nèi)，每孔加入1∶40稀釋的底物50μL，于37℃下震蕩孵育3 h后加入50μL終止液，以酶標(biāo)儀在360 nm激發(fā)光以及460 nm發(fā)射波長檢測吸光度，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算ASMase活性。

1.2.3 Cer蛋白表達(dá)檢測 采用免疫熒光染色法測定VES組、VES+DES組在0、1.5、3、6、9 h細(xì)胞中的Cer蛋白表達(dá)。6孔板中細(xì)胞用冷PBS清洗2次后在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，清洗細(xì)胞后室溫下以0.1%的Triton X-100處理15 min，阻斷緩沖液孵育1 h，用4μg/mL的抗Cer抗體孵育細(xì)胞過夜后再用二抗孵育1 h，用激光共聚焦儀獲取圖像。

1.2.4 DAPI染色檢測凋亡率 收集培養(yǎng)基中的死亡細(xì)胞和貼壁生長的細(xì)胞至Eppendorf管中，洗細(xì)胞2次，每管加入2μg/mL的DAPI 50μL，吹打混勻后在37℃、避光條件下孵育30 min，洗細(xì)胞2次后取細(xì)胞懸液滴于載玻片上，在300～500 nm紫外波長下以倒置熒光顯微鏡觀察凋亡小體(目鏡×物鏡=400)，每組均隨機(jī)選取不低于100個細(xì)胞的視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算百分比并拍照。

1.2.5 死亡受體相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測 以Western blot法檢測各組細(xì)胞中Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP的蛋白表達(dá)情況。收集各組處理24 h的細(xì)胞，裂解并提取蛋白，等量上樣，SDS-PAGE電泳分離后常規(guī)轉(zhuǎn)膜、封閉，與一抗雜交過夜，再用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗于37℃條件下孵育1 h，用數(shù)字成像儀對圖像進(jìn)行拍照并分析。

1.2.6 檢測氧化應(yīng)激反應(yīng) 將各組細(xì)胞收集后懸浮于終濃度為10μmol/L的2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽中，使細(xì)胞濃度為5×106/mL，37℃下避光孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻一次，之后用培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次備用。以流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生率(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以xˉ±s表示，對照組、DES組、DES+VES組及VES組細(xì)胞的凋亡率，DR5、Fas、c-caspase-8、c-caspase-9和c-PARP蛋白表達(dá)，氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生率間差異的分析均采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中ASMase活性

按試劑盒方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=192.08 X+2 183.17(r=0.998)，提示ASMase活性與相對熒光單位間的相關(guān)性良好。VES處理細(xì)胞0、1.5、3、6 h后細(xì)胞中ASMase比活力分別為476.35、658.60、923.85和717.90 U/mg，提示VES處理后胃癌細(xì)胞中的ASMase活性隨時間逐漸增加，在3 h達(dá)到高峰，隨后逐漸降低；DES+VES組細(xì)胞中的ASMase活性在上述時間點(diǎn)的比活力分別為87.75、93.80、98.55和98.70 U/mg，提示DES抑制了SGC-7901細(xì)胞中ASMase的基礎(chǔ)活性及VES的促ASMase表達(dá)作用，結(jié)果見圖1。

2.2 各組細(xì)胞中Cer蛋白的表達(dá)

圖1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測SGC-7901細(xì)胞的ASMase活性

采用免疫熒光法檢測VES處理0、1.5、3、6、9 h后細(xì)胞中的Cer蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cer蛋白在Ves處理1.5 h開始升高并聚集于細(xì)胞膜上，在6 h時的熒光強(qiáng)度最高，隨后開始降低；以DES抑制ASMase活性后，再以VES處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中Cer在0、1.5、3、6、9 h的表達(dá)均受到抑制，提示DES能夠通過抑制ASMase活性來抑制Cer的表達(dá)，見圖2。

圖2 免疫熒光法檢測SGC-7901細(xì)胞Cer蛋白的表達(dá)情況

2.3 各組細(xì)胞的凋亡率

VES處理24 h后，對照組細(xì)胞鏡下細(xì)胞核均完整，染色質(zhì)均勻，無凋亡小體出現(xiàn)；DES組細(xì)胞鏡下細(xì)胞核及染色質(zhì)情況與對照組基本一致；VES組細(xì)胞鏡下有大量的細(xì)胞核發(fā)生碎裂，染色質(zhì)固縮，出現(xiàn)典型的凋亡小體；VES+DES組細(xì)胞與VES組相比，核質(zhì)和染色質(zhì)相對均勻完整，凋亡小體數(shù)量明顯減少，提示抑制ASMase后，VES促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用被降低，統(tǒng)計(jì)3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對照組與DES組的凋亡率無顯著差異[分別為(2.00±1.00)%和(2.67±0.57)%，P＞0.05]，DES+VES組凋亡率[(20.00±2.00)%]高于對照組和DES組(P均＜0.01)，低于VES組[(41.00±1.00)%，P＜0.01]，見圖3。

2.4 ASMase對死亡受體信號通路的影響

采用Western blot法檢測各組細(xì)胞中Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組及DES處理組細(xì)胞中的上述因子表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，提示DES本身不會促進(jìn)上述因子的表達(dá)；VES+DES組細(xì)胞中上述因子的表達(dá)水平較單獨(dú)VES處理組降低(P均＜0.01)，提示抑制ASMase活性后，VES促進(jìn)死亡受體信號通路表達(dá)的作用也受到了抑制，見圖4。

圖3 DAPI染色檢測SGC-7901細(xì)胞的凋亡率

圖4 Western blot法檢測細(xì)胞中DR5、Fas、caspase-8、caspase-9和PARP的蛋白表達(dá)水平

2.5 ASMase對氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

藥物作用24 h后，以活性氧探針處理細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的比例，檢測結(jié)果見圖5。表明對照組發(fā)生氧化應(yīng)激的細(xì)胞比例為(0.12±0.06)%；DES組細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的比例與對照組基本一致(P＞0.05)，說明DES不引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)；VES組細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的比例[(91.22±3.88)%]明顯高于對照組(P＜0.01)，而VES+DES組細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的比例[(64.04±2.58)%]較VES組明顯降低(P＜0.01)，提示ASMase參與了VES誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的過程。

3 討論

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測SGC-7901細(xì)胞中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的比例

目前在胃癌的常規(guī)治療手段中化療的毒副作用較大，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時亦殺傷正常的組織和細(xì)胞。VES具有極強(qiáng)的抑癌活性，能夠選擇性抑制多種屬來源的腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，但機(jī)制還未完全明確。本研究探討了ASMase在VES促進(jìn)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中Cer、氧化應(yīng)激反應(yīng)和死亡受體信號通路的表達(dá)，結(jié)合前期研究結(jié)果[2]，發(fā)現(xiàn)：①VES處理早期即可促進(jìn)細(xì)胞中ASMase活性升高；②VES能夠促進(jìn)Cer表達(dá)并聚集在細(xì)胞膜上；③抑制ASMase部分阻斷了VES促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用；抑制了Cer、Fas、DR5、裂解的caspase-8、caspase-9以及PARP的表達(dá)；抑制了細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示VES可能是通過ASMase來促進(jìn)Cer的表達(dá)做為上游調(diào)節(jié)因子，再分別通過死亡受體信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)3條通路來共同促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡的。

ASMase被激活后會迅速從細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外葉[5]，進(jìn)而水解膜鞘磷脂生成Cer，后者在細(xì)胞膜中的積累導(dǎo)致了質(zhì)膜的重建和富含神經(jīng)酰胺的平臺的形成，稱為“脂質(zhì)筏”[6]，并促進(jìn)Fas和DR5的聚集并使它們與其配體相結(jié)合，導(dǎo)致死亡受體依賴性凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果首次驗(yàn)證了VES能夠激活A(yù)SMase/Cer做為上游調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)下游的Fas和DR5表達(dá)，再使caspase-8裂解為c-caspase-8，通過線粒體途徑激活caspase-9及其下游因子，使細(xì)胞中的DNA修復(fù)酶PARP被剪切，最終誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡，與Li等人[7]發(fā)現(xiàn)α-生育酚醚鏈乙酸在誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡和Palau等人[8]報(bào)道的γ-生育三烯醇在誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡時的機(jī)制相同。因此，我們認(rèn)為ASMase/Cer-死亡受體信號途徑可能是具有抗癌活性的維生素E衍生物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的共同機(jī)制。

在正常情況下細(xì)胞內(nèi)的ROS處于正常水平，并不會對細(xì)胞造成損傷，當(dāng)細(xì)胞受到不利的外來刺激時會使ROS在細(xì)胞內(nèi)蓄積從而發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。本研究的結(jié)果表明VES能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)來促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，與本課題組之前的結(jié)果相一致[3]。但以DES抑制ASMase活性后，VES誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡和活性氧蓄積的能力僅被部分阻斷，說明ASMase/Cer可能僅是VES誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制之一。目前ASMase與ROS之間的上下游關(guān)系還存在爭論，也有研究表明細(xì)胞中ROS能夠調(diào)節(jié)ASMase進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是ASMase的上游信號通路[10]，因此我們推測在VES誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中ASMase與氧化應(yīng)激反應(yīng)可能存在交互作用。此外，本課題組前期研究表明VES在促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)也存在交互作用，因此，推測ASMase、氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激三者之間均存在交互作用，有待于下一步工作來明確上述推論。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASMase/Cer可能是VES通過死亡受體信號通路及氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中的上游因子，其下游途徑包括死亡受體信號通路以及氧化應(yīng)激反應(yīng)，但抑制ASMase活性后，VES的促凋亡和活性氧蓄積的作用并未被完全阻斷，推測ASMase與ROS之間存在交互作用，有待于進(jìn)一步研究。