張旭光，杜瑞琥，陳彥平，趙 艷*

(1．哈爾濱市兒童醫(yī)院兒童保健科，黑龍江哈爾濱 150010；2．哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學專業(yè)，黑龍江 哈爾濱 150081；3．哈爾濱醫(yī)科大學營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

胃癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，臨床上治療胃癌的手段主要有手術與化療，但常規(guī)化療藥物副作用大，加之腫瘤細胞常對化療藥物產(chǎn)生耐藥，從而限制了化療藥物的臨床應用[1]。維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的衍生物，VES對胃癌等多種腫瘤細胞均能表現(xiàn)出極強的殺傷作用，而對正常細胞卻無任何毒副作用。本課題組前期研究結果表明VES能夠通過激活酸性神經(jīng)磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASmase)作為起始因子來促進胃癌細胞發(fā)生凋亡，其下游信號通路包含了內(nèi)質網(wǎng)應激途徑，但ASMase早期活化后其下游因子神經(jīng)酰胺的聚集情況還未明確[2]。此外，本課題組早期研究還發(fā)現(xiàn)VES能夠通過死亡受體信號通路、氧化應激途徑促進人胃癌細胞發(fā)生凋亡，而ASMase與上述兩條信號通路之間的關系也尚未明確[3-4]。因此，本研究擬進一步探討VES通過ASMase促進人胃癌細胞發(fā)生凋亡過程中神經(jīng)酰胺的聚集變化、死亡受體信號通路及氧化應激反應在這一過程中的作用，以進一步明確VES在促進人胃癌細胞發(fā)生凋亡過程中各信號通路的上下游關系。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

低分化人胃癌細胞株SGC-7901由哈爾濱醫(yī)科大學營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室保存。VES、ASMase抑制劑地昔帕明(desipramine，DES)與抗Cer抗體均購自美國Sigma公司，ASMase活性試劑盒購自美國Echelon Biosciences公司，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自美國Invitrogen公司；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)探針購自碧云天生物技術研究所；Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP多克隆抗體均購自美國Cell Signal公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 人胃癌SGC-7901細胞在含有10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為溫度37℃，CO2體積分數(shù)5%。待其生長狀態(tài)良好后，用0.02%EDTA消化傳代，細胞鋪滿85%瓶底面積時，棄去原培養(yǎng)液，更換為2%RPMI-1640培養(yǎng)液并加受試物處理：VES組用20 μg/mL VES處理細胞；VES+DES組用12.5μmol/L DES預處理細胞2 h，再加20μg/mL VES處理細胞；陰性對照組用2%RPMI-1640培養(yǎng)液處理細胞；DES組用12.5μmol/L DES提前2 h處理細胞。分別在不同時間點檢測VES組和VES+DES組中ASMase和Cer的表達情況來確定兩者表達高峰的出現(xiàn)時間和DES對兩者的抑制作用。根據(jù)本課題組前期研究結果，選擇VES作用后細胞發(fā)生凋亡最明顯的時間點(24 h)檢測4組細胞的凋亡率、死亡受體信號通路蛋白表達和氧化應激情況。

1.2.2 ASMase活性檢測 收集VES組、VES+DES組0、1.5、3、6 h的細胞各1.5×106個，超聲裂解后取上清液20μL(含20μg蛋白)分別置于96孔板內(nèi)，每孔加入1∶40稀釋的底物50μL，于37℃下震蕩孵育3 h后加入50μL終止液，以酶標儀在360 nm激發(fā)光以及460 nm發(fā)射波長檢測吸光度，代入到標準曲線中計算ASMase活性。

1.2.3 Cer蛋白表達檢測 采用免疫熒光染色法測定VES組、VES+DES組在0、1.5、3、6、9 h細胞中的Cer蛋白表達。6孔板中細胞用冷PBS清洗2次后在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，清洗細胞后室溫下以0.1%的Triton X-100處理15 min，阻斷緩沖液孵育1 h，用4μg/mL的抗Cer抗體孵育細胞過夜后再用二抗孵育1 h，用激光共聚焦儀獲取圖像。

1.2.4 DAPI染色檢測凋亡率 收集培養(yǎng)基中的死亡細胞和貼壁生長的細胞至Eppendorf管中，洗細胞2次，每管加入2μg/mL的DAPI 50μL，吹打混勻后在37℃、避光條件下孵育30 min，洗細胞2次后取細胞懸液滴于載玻片上，在300～500 nm紫外波長下以倒置熒光顯微鏡觀察凋亡小體(目鏡×物鏡=400)，每組均隨機選取不低于100個細胞的視野計數(shù)陽性細胞，計算百分比并拍照。

1.2.5 死亡受體相關蛋白的表達檢測 以Western blot法檢測各組細胞中Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP的蛋白表達情況。收集各組處理24 h的細胞，裂解并提取蛋白，等量上樣，SDS-PAGE電泳分離后常規(guī)轉膜、封閉，與一抗雜交過夜，再用堿性磷酸酶標記的二抗于37℃條件下孵育1 h，用數(shù)字成像儀對圖像進行拍照并分析。

1.2.6 檢測氧化應激反應 將各組細胞收集后懸浮于終濃度為10μmol/L的2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽中，使細胞濃度為5×106/mL，37℃下避光孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻一次，之后用培養(yǎng)液洗細胞2次備用。以流式細胞儀檢測各組細胞的氧化應激反應發(fā)生率(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結果以xˉ±s表示，對照組、DES組、DES+VES組及VES組細胞的凋亡率，DR5、Fas、c-caspase-8、c-caspase-9和c-PARP蛋白表達，氧化應激反應發(fā)生率間差異的分析均采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 各組細胞中ASMase活性

按試劑盒方法制作標準曲線為Y=192.08 X+2 183.17(r=0.998)，提示ASMase活性與相對熒光單位間的相關性良好。VES處理細胞0、1.5、3、6 h后細胞中ASMase比活力分別為476.35、658.60、923.85和717.90 U/mg，提示VES處理后胃癌細胞中的ASMase活性隨時間逐漸增加，在3 h達到高峰，隨后逐漸降低；DES+VES組細胞中的ASMase活性在上述時間點的比活力分別為87.75、93.80、98.55和98.70 U/mg，提示DES抑制了SGC-7901細胞中ASMase的基礎活性及VES的促ASMase表達作用，結果見圖1。

2.2 各組細胞中Cer蛋白的表達

圖1 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測SGC-7901細胞的ASMase活性

采用免疫熒光法檢測VES處理0、1.5、3、6、9 h后細胞中的Cer蛋白表達情況，結果發(fā)現(xiàn)Cer蛋白在Ves處理1.5 h開始升高并聚集于細胞膜上，在6 h時的熒光強度最高，隨后開始降低；以DES抑制ASMase活性后，再以VES處理細胞，結果發(fā)現(xiàn)細胞中Cer在0、1.5、3、6、9 h的表達均受到抑制，提示DES能夠通過抑制ASMase活性來抑制Cer的表達，見圖2。

圖2 免疫熒光法檢測SGC-7901細胞Cer蛋白的表達情況

2.3 各組細胞的凋亡率

VES處理24 h后，對照組細胞鏡下細胞核均完整，染色質均勻，無凋亡小體出現(xiàn)；DES組細胞鏡下細胞核及染色質情況與對照組基本一致；VES組細胞鏡下有大量的細胞核發(fā)生碎裂，染色質固縮，出現(xiàn)典型的凋亡小體；VES+DES組細胞與VES組相比，核質和染色質相對均勻完整，凋亡小體數(shù)量明顯減少，提示抑制ASMase后，VES促進胃癌細胞發(fā)生凋亡的作用被降低，統(tǒng)計3次平行實驗結果，發(fā)現(xiàn)對照組與DES組的凋亡率無顯著差異[分別為(2.00±1.00)%和(2.67±0.57)%，P＞0.05]，DES+VES組凋亡率[(20.00±2.00)%]高于對照組和DES組(P均＜0.01)，低于VES組[(41.00±1.00)%，P＜0.01]，見圖3。

2.4 ASMase對死亡受體信號通路的影響

采用Western blot法檢測各組細胞中Fas、DR5、caspase-8、caspase-9以及PARP蛋白的表達。結果發(fā)現(xiàn)對照組及DES處理組細胞中的上述因子表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，提示DES本身不會促進上述因子的表達；VES+DES組細胞中上述因子的表達水平較單獨VES處理組降低(P均＜0.01)，提示抑制ASMase活性后，VES促進死亡受體信號通路表達的作用也受到了抑制，見圖4。

圖3 DAPI染色檢測SGC-7901細胞的凋亡率

圖4 Western blot法檢測細胞中DR5、Fas、caspase-8、caspase-9和PARP的蛋白表達水平

2.5 ASMase對氧化應激反應的影響

藥物作用24 h后，以活性氧探針處理細胞，采用流式細胞術檢測細胞發(fā)生氧化應激的比例，檢測結果見圖5。表明對照組發(fā)生氧化應激的細胞比例為(0.12±0.06)%；DES組細胞發(fā)生氧化應激的比例與對照組基本一致(P＞0.05)，說明DES不引起細胞發(fā)生氧化應激反應；VES組細胞發(fā)生氧化應激反應的比例[(91.22±3.88)%]明顯高于對照組(P＜0.01)，而VES+DES組細胞發(fā)生氧化應激反應的比例[(64.04±2.58)%]較VES組明顯降低(P＜0.01)，提示ASMase參與了VES誘導胃癌細胞發(fā)生氧化應激反應的過程。

3 討論

圖5 流式細胞術檢測SGC-7901細胞中發(fā)生氧化應激反應的比例

目前在胃癌的常規(guī)治療手段中化療的毒副作用較大，在殺傷腫瘤細胞的同時亦殺傷正常的組織和細胞。VES具有極強的抑癌活性，能夠選擇性抑制多種屬來源的腫瘤細胞增殖并誘導細胞發(fā)生凋亡，但機制還未完全明確。本研究探討了ASMase在VES促進人胃癌SGC-7901細胞發(fā)生凋亡過程中Cer、氧化應激反應和死亡受體信號通路的表達，結合前期研究結果[2]，發(fā)現(xiàn)：①VES處理早期即可促進細胞中ASMase活性升高；②VES能夠促進Cer表達并聚集在細胞膜上；③抑制ASMase部分阻斷了VES促進細胞發(fā)生凋亡的作用；抑制了Cer、Fas、DR5、裂解的caspase-8、caspase-9以及PARP的表達；抑制了細胞內(nèi)發(fā)生的內(nèi)質網(wǎng)應激以及氧化應激反應，提示VES可能是通過ASMase來促進Cer的表達做為上游調節(jié)因子，再分別通過死亡受體信號通路、內(nèi)質網(wǎng)應激和氧化應激反應3條通路來共同促進胃癌SGC-7901細胞發(fā)生凋亡的。

ASMase被激活后會迅速從細胞內(nèi)囊泡轉移到質膜的外葉[5]，進而水解膜鞘磷脂生成Cer，后者在細胞膜中的積累導致了質膜的重建和富含神經(jīng)酰胺的平臺的形成，稱為“脂質筏”[6]，并促進Fas和DR5的聚集并使它們與其配體相結合，導致死亡受體依賴性凋亡的發(fā)生。本研究結果首次驗證了VES能夠激活ASMase/Cer做為上游調節(jié)因子，促進下游的Fas和DR5表達，再使caspase-8裂解為c-caspase-8，通過線粒體途徑激活caspase-9及其下游因子，使細胞中的DNA修復酶PARP被剪切，最終誘導胃癌SGC-7901細胞發(fā)生凋亡，與Li等人[7]發(fā)現(xiàn)α-生育酚醚鏈乙酸在誘導乳腺癌細胞發(fā)生凋亡和Palau等人[8]報道的γ-生育三烯醇在誘導胰腺癌細胞發(fā)生凋亡時的機制相同。因此，我們認為ASMase/Cer-死亡受體信號途徑可能是具有抗癌活性的維生素E衍生物誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的共同機制。

在正常情況下細胞內(nèi)的ROS處于正常水平，并不會對細胞造成損傷，當細胞受到不利的外來刺激時會使ROS在細胞內(nèi)蓄積從而發(fā)生氧化應激反應[9]。本研究的結果表明VES能夠誘導SGC-7901細胞發(fā)生氧化應激反應來促進細胞發(fā)生凋亡，與本課題組之前的結果相一致[3]。但以DES抑制ASMase活性后，VES誘導SGC-7901細胞發(fā)生凋亡和活性氧蓄積的能力僅被部分阻斷，說明ASMase/Cer可能僅是VES誘導胃癌細胞發(fā)生氧化應激反應的機制之一。目前ASMase與ROS之間的上下游關系還存在爭論，也有研究表明細胞中ROS能夠調節(jié)ASMase進而促進細胞發(fā)生凋亡，提示氧化應激反應可能是ASMase的上游信號通路[10]，因此我們推測在VES誘導SGC-7901細胞發(fā)生凋亡的過程中ASMase與氧化應激反應可能存在交互作用。此外，本課題組前期研究表明VES在促進胃癌細胞發(fā)生凋亡過程中氧化應激反應與內(nèi)質網(wǎng)應激反應也存在交互作用，因此，推測ASMase、氧化應激反應和內(nèi)質網(wǎng)應激三者之間均存在交互作用，有待于下一步工作來明確上述推論。

綜上所述，本研究結果發(fā)現(xiàn)ASMase/Cer可能是VES通過死亡受體信號通路及氧化應激反應促進胃癌SGC-7901細胞發(fā)生凋亡過程中的上游因子，其下游途徑包括死亡受體信號通路以及氧化應激反應，但抑制ASMase活性后，VES的促凋亡和活性氧蓄積的作用并未被完全阻斷，推測ASMase與ROS之間存在交互作用，有待于進一步研究。