孫全武，杜小平*，郝 杰，時(shí) 榮，劉 波，黃海云

(甘肅省人民醫(yī)院乳腺外科，甘肅 蘭州 730000)

乳頭溢液是女性患者在乳腺科門診常見就診原因之一[1]。雖然導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤是病理性乳頭溢液(pathological nipple discharge，PND)的最常見病因，但既往研究發(fā)現(xiàn)，2.8%～21.3%的女性乳頭溢液患者最終被診斷為乳腺癌[2]，因?yàn)楫?dāng)乳腺癌侵犯大導(dǎo)管引起乳管內(nèi)出血性或?qū)Ч軆?nèi)乳頭狀癌刺激乳管分泌增加，可出現(xiàn)病理性乳頭溢液。一項(xiàng)meta分析納入3 110名乳頭溢液患者，結(jié)果乳腺癌的發(fā)病率占18.7%[3]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)整合素β1高表達(dá)與浸潤性微乳頭狀癌的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。我們前期通過meta分析發(fā)現(xiàn)整合素β1高表達(dá)與乳腺癌總生存期低顯著相關(guān)[5]， 合 并 風(fēng) 險(xiǎn) 比 HR=1.88， 95%CI(1.46， 2.42)(P＜0.01)；整合素β1高表達(dá)與乳腺癌無病生存期降低顯著相關(guān)，合并HR=1.63，95%CI(1.17，2.25)(P＜0.01)。目前，以病理性乳頭溢液為首發(fā)癥狀的乳腺癌患者病理特征研究較少，本研究采用免疫組化檢測乳腺癌伴病理性乳頭溢液患者癌組織中整合素β1的表達(dá)，并選取同期以乳房腫塊或體檢發(fā)現(xiàn)異常而就診的乳腺癌病例作為對照，分析整合素β1與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，探討其對乳腺癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

自甘肅省人民醫(yī)院病案管理系統(tǒng)調(diào)閱2006年1月1日—2013年12月31日期間在乳腺外科行手術(shù)治療的乳腺癌病例資料。檢索這些患者的臨床資料，包括初診時(shí)年齡、絕經(jīng)狀況、腫瘤大小、是否轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)、術(shù)后病檢及免疫組化結(jié)果、術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡時(shí)間。排除隨訪資料不完整、后續(xù)在其他醫(yī)院復(fù)查以及Her-2檢測不確定的患者。以該院收治的112例伴乳頭溢液就診的乳腺癌作為研究對象(PND組)，部分患者查體或影像學(xué)檢查可伴有乳房腫塊。選取同期以乳房腫塊或體檢發(fā)現(xiàn)異常而就診的112例乳腺癌作為對照組，這部分患者在發(fā)病過程以及體格檢查均未見乳頭溢液。在該院病理科調(diào)取以上患者標(biāo)本，所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定及石蠟包埋，采用免疫組化檢測乳腺癌組織中整合素β1的表達(dá)。

1.2 方法

1.2.1 病理及免疫組化檢測方法 分析以下臨床因素和病理組織學(xué)指標(biāo)：年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)和雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)狀態(tài)、人表皮生長因子受體-2(Her-2)狀態(tài)等。ER、PR、Ki-67、Her-2為術(shù)后常規(guī)檢測，數(shù)據(jù)記錄在病案數(shù)據(jù)庫。ER和PR免疫組化檢測結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[6]，Her-2/neu蛋白(+++)陽性表達(dá)者直接確定為陽性，(++)陽性表達(dá)者進(jìn)一步行多重?zé)晒庠浑s交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測，根據(jù)基因擴(kuò)增結(jié)果確定為陽性或陰性，具體判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]，對于個(gè)別Her-2的FISH檢測結(jié)果不確定者送其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步核實(shí)，確保Her-2檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。免疫組化用切片厚4μm，抗體為小鼠抗人整合素β1(1∶100稀釋)單克隆抗體(4B7R)，美國圣克魯斯生物科技公司產(chǎn)品。根據(jù)常規(guī)親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(avidin biotin-peroxidase comples，ABC)使用DAKO全自動免疫組化儀染色。免疫組化結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[8]，根據(jù)染色強(qiáng)度(無色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分)，腫瘤細(xì)胞膜或核陽性染色百分比(＜10%計(jì) 0分、≥10%～25%計(jì) 1分、≥25%～50%計(jì)2分、≥50%計(jì)3分)，染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≤4分確定為陰性(-)，≥6分確定為陽性(+)。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism 7.0軟件繪制生存曲線；其余統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0軟件，率的比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)，Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析單因素及多因素對伴乳頭溢液組患者總生存期的影響，Kendall’s tau-b檢驗(yàn)分析伴乳頭溢液組整合素β1表達(dá)與Her-2的相關(guān)性；卡方檢驗(yàn)分析伴乳頭溢液組整合素β1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料的對比

伴病理性乳頭溢液組與對照組患者在年齡構(gòu)成、腫瘤大小、組織學(xué)分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面基線值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)，說明兩組患者間具有可比性。

表1 伴病理性乳頭溢液組與對照組患者資料及病理學(xué)特征基線值對比(n=112)

2.2 伴乳頭溢液組整合素β1的陽性表達(dá)

癌組織整合素β1免疫組化結(jié)果見圖1。伴乳頭溢液組整合素β1陽性表達(dá)率為14.29%(16/112)，顯著低于對照組陽性表達(dá)率25%(28/112)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.073，P=0.044)；伴乳頭溢液組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)整合素β1陽性表達(dá)率明顯高于無轉(zhuǎn)移者(P均＜0.05)，見表2。

圖1 乳腺癌組織整合素β1免疫組化結(jié)果(×200)

表2 整合素β1在伴乳頭溢液組癌組織中的表達(dá)情況

2.3 整合素β1表達(dá)對乳腺癌預(yù)后的影響

Kaplan Meier法生存分析發(fā)現(xiàn)，對照組總生存期明顯低于伴乳頭溢液組(HR=1.773，P=0.012)，伴乳頭溢液組整合素β1高表達(dá)患者的總生存期明顯低于低表達(dá)組(HR=2.573，P=0.023)，見圖2。進(jìn)一步采用Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析單變量和多變量對伴乳頭溢液組患者總生存期的影響。結(jié)果顯示乳頭溢液組整合素β1的表達(dá)與Her-2呈正相關(guān)(r=0.281，P=0.001)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級以及整合素β1高表達(dá)是影響伴乳頭溢液組乳腺癌患者總生存期的3個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均＜0.01)，見表3和表4。

圖2 乳腺癌患者生存曲線圖

3 討論

整合素β1作為黏附分子與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān)，最近研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素-1與整合素β1的結(jié)合通過促進(jìn)生存素在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)而增強(qiáng)了耐藥性[9]。整合素β1與Her-2共享部分信號通路下游分子，如磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號通路[10]。Lesniak 等[11]采用小干擾 RNA基因敲低整合素β1的表達(dá)，證明整合素β1高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖是通過活化PI3K/Akt和ERK1/2信號通路活性而起作用。而曲妥珠單抗是通過拮抗Her-2/PI3K/Akt信號活性抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外，整合素介導(dǎo)的生長因子受體活化可能進(jìn)一步觸發(fā)其他生存信號機(jī)制，并抵消曲妥珠單抗的抗腫瘤作用[11]，所以整合素β1高表達(dá)會降低曲妥珠單抗對Her-2陽性乳腺癌的療效。而且整合素β1通過細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用活化PI3K/Akt信號通路，保護(hù)乳腺癌細(xì)胞免受化療[12]或電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]，所以整合素β1表達(dá)不但降低曲妥珠單抗的抗腫瘤作用，而且影響腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性，顯著影響乳腺癌的預(yù)后。

表3 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析單變量對乳頭溢液組患者總生存期的影響

表4 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析多變量對乳頭溢液組患者總生存期的影響

已有研究[14]證明，整合素可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲。整合素β1是整合素家族最廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的生物標(biāo)記物，可預(yù)測腫瘤患者的臨床過程和預(yù)后[15]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示伴乳頭溢液組整合素β1陽性表達(dá)率為14.29%(16/112)，顯著低于對照組陽性表達(dá)率25%(28/112)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.073，P=0.044)；伴乳頭溢液組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)整合素β1陽性表達(dá)率明顯高于無轉(zhuǎn)移者(P均＜0.05)；且乳頭溢液組患者整合素β1高表達(dá)者總生存期顯著降低，提示整合素β1表達(dá)水平越高預(yù)后越差。這與整合素β1陽性表達(dá)與乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等預(yù)后不良密切相關(guān)的結(jié)論相符合[15]。早期納入研究的部分患者因交通條件受限以及術(shù)后不按時(shí)復(fù)查，無病生存期數(shù)據(jù)有偏差，所以，未分析整合素β1高表達(dá)對乳頭溢液組患者無病生存期的影響。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子可以通過上調(diào)和(或)活化整合素β1促進(jìn)血管形成，進(jìn)一步采用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，阻斷整合素β1表達(dá)后所有血管生成過程均受到抑制(包括黏連、遷移、毛細(xì)血管形態(tài)發(fā)生)，因此，他們提出整合素α6β1與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至大腦密切相關(guān)。針對整合素β1的靶向治療或許能延緩乳腺癌腦轉(zhuǎn)移、延長乳腺癌患者總生存期和無病生存期。近來，國外學(xué)者曾針對Her-3和整合素β1聯(lián)合靶向治療Her-2陽性乳腺癌，發(fā)現(xiàn)是一種非常有效的治療措施，且證實(shí)了Her-3也是介導(dǎo)Her-2陽性乳腺癌進(jìn)展的主要因素[17]。今后采用抗Her-2、Her-3以及整合素β1的多靶點(diǎn)治療或許成為Her-2陽性乳腺癌的治療方向。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)整合素β1在伴乳頭溢液組的癌組織高表達(dá)可顯著降低乳腺癌患者總生存期，可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，整合素β1有望成為判定乳腺癌預(yù)后的新指標(biāo)。與其他首發(fā)癥狀為主的患者相比，以乳頭溢液為首發(fā)癥狀的乳腺癌預(yù)后相對較好，如果及時(shí)篩查、早發(fā)現(xiàn)、早診治，將會顯著提高其治愈率。本次研究的局限性在于納入Her-2陽性乳腺癌例數(shù)較少、可能導(dǎo)致研究結(jié)果偏倚，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)其對伴乳頭溢液組患者總生存期無明顯影響。以及出院后的治療依存性等都會影響本次研究結(jié)果，所以研究結(jié)論尚需多中心大量本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。今后更嚴(yán)格地選擇對曲妥珠單抗治療敏感的患者，盡量減少不必要的藥物毒性，如心臟事件[18]，避免因整合素β1過表達(dá)引起曲妥珠單抗治療無效或療效不佳。對于整合素β1過表達(dá)的乳腺癌患者，探索新的替代治療策略，如研制針對整合素β1的小分子或抗體抑制劑或許能進(jìn)一步提高療效、延長總生存期。