溫 轉(zhuǎn)，檀碧波，李 勇，*，趙 群，范立僑，王 冬，爾麗綿

(1．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院質(zhì)量控制辦公室，河北 石家莊 050011；2．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011；3．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)鏡室，河北 石家莊 050011)

胃癌在我國的發(fā)病率與死亡率高居第2位，僅次于肺癌，并且進(jìn)展期胃癌占大多數(shù)[1]?；熢谖覈赴┑木C合治療中占有重要地位，但多藥耐藥性(multidrug resistance)常影響化療效果[2-3]。microRNA(miR)通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄后的水平，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與耐藥[4-6]。有報道，miR-95為microRNA家族中的一員，參與乳腺癌、前列腺癌的抗輻射性及肺癌對放化療的耐藥[5，7]。但關(guān)于miR-95在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌細(xì)胞耐藥性的關(guān)系尚不明確。本研究應(yīng)用qPCR法檢測miR-95在胃癌組織中的表達(dá)，并應(yīng)用miR-95抑制物(anti-miR-95)和miR-95模擬物(miR-95 mimics)分別轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC7901，檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞經(jīng)洛鉑(lobaplatin，LBP)處理后細(xì)胞活性的變化，探討miR-95與胃癌細(xì)胞對洛鉑敏感性的關(guān)系及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2017年1月—2017年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科手術(shù)切除的胃腺癌組織標(biāo)本，共30例，術(shù)前均未接受放、化療，未同時合并其他腫瘤?；颊吣?1例，女9例。年齡45～70歲，平均年齡(60.7±15.8)歲，中位年齡62歲。術(shù)中分別取新鮮腫瘤組織和距腫瘤邊緣超過3 cm的癌旁正常胃黏膜組織(手術(shù)后病理證實(shí)無癌細(xì)胞存在)各2份，1份于術(shù)中離體后立即放入液氮速凍，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?；?份在2 h內(nèi)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。所有患者均簽署知情同意書，本實(shí)驗獲得河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株及試劑

人胃癌細(xì)胞株SGC7901購置于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。TRIzol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量RT-PCR試劑為美國Promega公司產(chǎn)品。Anti-miR95、miR-95 mimics購自中國百奧邁科生物技術(shù)有限公司。miR-95熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國Signosis公司。MDR1、GST-π、LRP、Survivin及β-actin抗體購自美國Sigma公司，xIAP、Bad抗體購自英國Abcam公司。CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒購自同仁化學(xué)研究所。洛鉑為海南長安醫(yī)藥公司產(chǎn)品(每支50 mg，批準(zhǔn)文號H20050308)。

1.3 胃癌組織單細(xì)胞懸液的制備和細(xì)胞培養(yǎng)

取術(shù)中切除的胃癌新鮮組織1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm，在2 h內(nèi)經(jīng)充分研磨，用200目細(xì)胞篩過濾制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育。每3 d用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，每1～2 d對培養(yǎng)基進(jìn)行換液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗。

1.4 基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組

實(shí)驗分為miR-95 mimic或Anti-miR-95轉(zhuǎn)染組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無關(guān)序列)及空白對照組(僅轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000)。取對數(shù)生長期(傳代分瓶后48 h)的SGC7901細(xì)胞，鋪至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融鋪滿70%～80%瓶底面積時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先，經(jīng)胰酶消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，然后按照轉(zhuǎn)染試劑說明書制備轉(zhuǎn)染液：在EP管中制備A液(不含血清的培養(yǎng)基稀釋miRNA)和B液(不含血清培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體)，分別將A液與B液輕彈混勻，靜置5 min，吸取B液加入至A液中，輕彈混勻，室溫中置10～15 min后，緩緩加入培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，37℃孵育48 h，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染的miRNA為化學(xué)合成核酸序列，無表達(dá)載體，同時標(biāo)記有綠色熒光，可于熒光顯微鏡下直接觀察轉(zhuǎn)染效率)。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR法檢測胃癌組織和細(xì)胞中m iR-95的表達(dá)水平及基因轉(zhuǎn)染后目的基因轉(zhuǎn)錄水平

用Trizol提取組織及轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取2 mg總RNA建立20 mL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，37℃反應(yīng)30 min，將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。使用相應(yīng)靶基因引物及Go Taq?qPCR Master Mix建立20 mL實(shí)時熒光定量PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qPCR)反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)程序如下：95℃、5 min，然后40個循環(huán)反應(yīng)：94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、30 s，于每個循環(huán)的第3個步驟(即72℃、30 s)末期收集熒光信號。U6作為micro RNA的內(nèi)參，GAPDH作為mRNA的內(nèi)參。檢測結(jié)果采用2-ΔΔCT方法計算，得到各mRNA表達(dá)的相對定量值。miR-95的檢測采用Gene Copoia公司的All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit微小RNA檢測試劑盒?；虻囊镄蛄幸姳?。

1.6 CCK-8法檢測胃癌組織原代細(xì)胞及基因轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞對洛鉑的敏感性

取方法1.3制備的胃癌組織細(xì)胞和胃癌細(xì)胞系以3×104個/mL的濃度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，加入濃度為8μg/mL的洛鉑后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組細(xì)胞均設(shè)置6個復(fù)孔。終止培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)液，加入100 μL含CCK-8的培養(yǎng)液(VCCK-8∶V培養(yǎng)液=1∶9)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀于490 nm處測吸光度D(490)值[D(490)值越小則細(xì)胞存活率越低，對化療藥物敏感性越高]。

表1 各基因引物序列

1.7 Western blot法檢測目的蛋白的表達(dá)

分別提取各細(xì)胞總蛋白，并檢測蛋白濃度。取40μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后，加入抗 MDR1、GST-π、LRP、Survivin、xIAP、Bad、β-actin一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，經(jīng)Odyssey紅外成像系統(tǒng)分析，檢測各條帶的光密度積分值(integral value of optical density，IOD)，以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白IOD值的比值代表蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩樣本均數(shù)比較時，使用t檢驗；對符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)比較，采用近似t檢驗；對方差不齊數(shù)據(jù)處理，用Wilcoxon檢驗；對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩樣本均數(shù)比較、多樣本均數(shù)比較時，用方差分析；對符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較、多個樣本均數(shù)間的兩兩比較采用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)；非正態(tài)分布或(和)方差不齊的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis H檢驗。以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-95在胃癌組織中的表達(dá)

胃癌組織miR-95的相對表達(dá)水平(0.106±0.023)顯著高于癌旁組織(0.046±0.025)(P＜0.05)。以癌組織miR-95相對表達(dá)水平的均值為界將胃癌組織分為miR-95高表達(dá)組17例，miR-95低表達(dá)組13例。

2.2 胃癌組織中m iR-95表達(dá)水平與洛鉑敏感性的關(guān)系

應(yīng)用CCK-8法分別檢測洛鉑對miR-95高、低表達(dá)的胃癌細(xì)胞(組織來源)的抑制率。結(jié)果顯示，洛鉑對miR-95表達(dá)水平高的胃癌細(xì)胞抑制率為(33.74±6.10)%，低于miR-95低表達(dá)的細(xì)胞(47.41±11.30)%(P＜0.05)。

2.3 anti-miR-95、miR-95 mim ics轉(zhuǎn)染對SGC7901細(xì)胞m iR-95表達(dá)的影響

在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率接近100%。qPCR實(shí)驗的結(jié)果見表2。anti-miR-95轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后，miR-95mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)；miR-95 mimics轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后，miR-95 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)。

表2 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞miR-95 mRNA表達(dá)水平的比較(n=3，)

表2 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞miR-95 mRNA表達(dá)水平的比較(n=3，)

與陰性對照組及空白組比較，*P＜0.05.

組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組anti-miR-95轉(zhuǎn)染0.305±0.073*0.968±0.064 1.025±0.86 miR-95 mimics轉(zhuǎn)染18.426±1.519*1.109±0.245 1.161±0.100

2.4 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染對SGC7901細(xì)胞對洛鉑敏感性的影響

CCK-8實(shí)驗的結(jié)果見表3。anti-miR-95轉(zhuǎn)染后，SGC7901細(xì)胞對洛鉑的敏感性明顯增加(P＜0.01)；miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后，SGC7901細(xì)胞對洛鉑的敏感性明顯下降(P＜0.01)。

表3 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞SGC7901細(xì)胞對洛鉑敏感性的比較(n=3，)

表3 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞SGC7901細(xì)胞對洛鉑敏感性的比較(n=3，)

與陰性對照組及空白組比較，*P＜0.05.

組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組anti-miR-95 0.526±0.141*1.120±0.106 1.180±0.119 miR-95 mimics 3.700±0.822*1.312±0.276 1.391±0.257

2.5 miR-95對 SGC7901細(xì)胞 MDR1、GST-π、LRP、Survivin、x IAP、Bad表達(dá)的影響

qPCR和Western blot實(shí)驗的結(jié)果見圖1和表4、5。anti-miR-95轉(zhuǎn)染后，SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MDR1、Survivin、xIAP mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，而Bad mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.05)；miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后，SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MDR1、Survivin、xIAP mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，而Bad mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；GST-π、LRP mRNA和蛋白表達(dá)在兩者轉(zhuǎn)染后均未見明顯改變(P＞0.05)。

圖1 Western blot檢測結(jié)果

表4 anti-miR-95轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞MDR1、Survivin、x IAP、Bad、GST-π、LRP m RNA和蛋白水平的比較(n=3，)

表4 anti-miR-95轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞MDR1、Survivin、x IAP、Bad、GST-π、LRP m RNA和蛋白水平的比較(n=3，)

與陰性對照組及空白對組比較，*P＜0.05.

組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組MDR1 mRNA 0.478±0.078*1.195±0.167 1.207±0.086蛋白0.366±0.075*1.181±0.131 0.168±0.105 Survivin mRNA 0.613±0.039*1.471±0.115 1.494±0.076蛋白0.483±0.057*0.951±0.102 0.982±0.088 xIAP mRNA 0.559±0.109*1.344±0.061 1.327±0.139蛋白0.406±0.076*1.049±0.125 1.034±0.041組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組Bad mRNA 1.903±0.071*0.754±0.056 0.786±0.090蛋白0.972±0.046*0.478±0.090 0.501±0.060 GST-π mRNA 0.857±0.140 0.808±0.061 0.791±0.104蛋白0.844±0.059 0.825±0.066 0.806±0.502 LRP mRNA 1.125±0.050 1.086±0.085 1.172±0.067蛋白1.369±0.258 1.544±0.240 1.595±0.222

表5 miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞MDR1、Survivin、xIAP、Bad、GST-π、LRP mRNA和蛋白水平的比較(n=3，)

表5 miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞MDR1、Survivin、xIAP、Bad、GST-π、LRP mRNA和蛋白水平的比較(n=3，)

與陰性對照組及空白對組比較，*P＜0.05.

組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組Bad mRNA 0.366±0.075*0.656±0.082 0.697±0.053蛋白0.457±0.070*1.087±0.096 0.965±0.050 GST-π mRNA 1.861±0.119 1.755±0.110 1.797±0.123蛋白0.870±0.045 0.887±0.076 0.884±0.026 LRP mRNA 1.760±0.077 1.809±0.142 1.832±0.104蛋白0.937±0.039 0.949±0.072 0.935±0.056組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組MDR1 mRNA 1.793±0.145*0.597±0.083 0.604±0.043蛋白1.064±0.170*0.561±0.101 0.585±0.083 Survivin mRNA 1.565±0.117*0.727±0.082 0.796±0.055蛋白0.917±0.114*0.601±0.090 0.627±0.083 xIAP mRNA 2.077±0.101*1.111±0.060 1.060±0.133蛋白1.193±0.114*0.571±0.036 0.539±0.053

3 討論

探討胃癌MDR機(jī)制及開發(fā)逆轉(zhuǎn)胃癌MDR藥物一直是胃癌治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。研究表明，miRNA主要通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄后水平參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與耐藥[7]。有報道表明，miR-95在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，可降低非小細(xì)胞肺癌的化療敏感性、增加其放療耐受性[5]。洛鉑是第三代鉑類化療藥物，在胃癌治療中取得了較好效果[8]。但由于胃癌細(xì)胞對化療藥物多存在明顯的原發(fā)性耐藥現(xiàn)象[9]，常導(dǎo)致治療效果不佳，甚至失敗。因此，探討胃癌組織細(xì)胞對洛鉑的耐藥機(jī)制有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-95在胃癌組織中高表達(dá)，miR-95表達(dá)水平高的胃癌組織細(xì)胞對洛鉑敏感性低于低表達(dá)者。抑制人胃癌細(xì)胞SGC7901 miR-95的表達(dá)后再給予洛鉑干預(yù)，細(xì)胞的增殖活性明顯增高；相反，提高miR-95表達(dá)后再給予洛鉑干預(yù)，細(xì)胞的增殖活性明顯降低。本結(jié)果提示miR-95表達(dá)增高可能是導(dǎo)致胃癌對洛鉑耐藥的重要原因，抑制miR-95表達(dá)有可能減輕胃癌細(xì)胞對洛鉑的耐藥性。

為探討miR-95參與胃癌組織細(xì)胞對洛鉑耐藥的機(jī)制，我們檢測了耐藥相關(guān)基因MDR1、GST-π、LRP、Survivin、xIAP、Bad在miR-95受到調(diào)控后的表達(dá)變化。MDR1是經(jīng)典MDR基因，其產(chǎn)物為P-糖蛋白(P-gp)。P-gp可將細(xì)胞內(nèi)的化療藥泵出細(xì)胞外[10-11]。GST-π通過將親脂性藥物與谷胱甘肽結(jié)合，增加其水溶性，將藥物排出細(xì)胞[12]。LRP能阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞核或?qū)⒓?xì)胞核內(nèi)的藥物泵出核外，再經(jīng)胞吐途徑排出細(xì)胞外[13-14]。腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑異常是造成MDR的另一重要機(jī)制，Survivin、xIAP、Bad均為其中重要成員，這些凋亡抑制基因的激活和凋亡促進(jìn)基因的抑制使細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染anti-miR-95后，SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MDR1、Survivin、xIAP表達(dá)明顯降低，Bad表達(dá)明顯增高；轉(zhuǎn)染miR-95 mimics后，SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MDR1、Survivin、xIAP表達(dá)明顯增高，而Bad表達(dá)明顯降低。同時，研究證實(shí)調(diào)控miR-95表達(dá)可影響細(xì)胞的增殖活性。有研究顯示，miR-95能夠通過促進(jìn)DKK3進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號通路導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[17]；還有研究發(fā)現(xiàn)miR-95可通過調(diào)節(jié)增殖相關(guān)蛋白p21而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[18]。本研究雖然未對miR-95影響胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制進(jìn)行深入分析，但這些結(jié)果為后續(xù)的研究提供了方向。這些結(jié)果提示，上述耐藥相關(guān)基因可能受到miR-95的調(diào)控，這可能是miR-95參與胃癌洛鉑耐藥的機(jī)制，但miR-95對這些基因調(diào)控的分子機(jī)制還有待深入研究。

綜上所述，胃癌組織中miR-95表達(dá)水平增高，且其表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞對洛鉑的藥物敏感性有關(guān)。miR-95可能通過調(diào)節(jié)一些耐藥相關(guān)基因如MDR1、Survivin、xIAP、Bad的表達(dá)而參與胃癌對洛鉑的耐藥形成。