萬 昕，胡 月，章 菊，陳 云，金佩佩，*

(1．中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院檢驗科，安徽 合肥 230036；2．中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心，安徽 合肥 230036；3．南京醫(yī)科大學微生物與免疫學系，江蘇 南京 211100)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是大腦中最常見的原發(fā)性腫瘤，約占所有腦惡性腫瘤的50%～60%[1]。傳統(tǒng)治療惡性腦膠質(zhì)瘤的首選方法是手術(shù)切除，再輔以化療、放療或綜合放化療，但是膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制復雜，加之其侵襲性生長等特性都使得臨床治療策略受到很大限制[2-4]。因此，進一步了解膠質(zhì)瘤相關(guān)發(fā)病機制顯得尤為重要。

最新研究提示病毒也可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的重要誘發(fā)因素。人類皰疹病毒6型(human herpesvirus 6，HHV-6)是一類嗜人淋巴細胞雙鏈DNA病毒，可分為A和B兩個亞型[5]。其中HHV-6A亞型被認為與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤存在相關(guān)性[6]。在膠質(zhì)瘤組織中可檢測到高百分比的HHV-6A核酸及蛋白質(zhì)成分，同時HHV-6A感染也可上調(diào)星形膠質(zhì)細胞分泌促炎細胞因子[7]。眾多研究顯示HHV-6A可能是一種影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要潛在病原體，但是其具體的致病或調(diào)控機制還有待進一步探索和驗證。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，它通過多種途徑調(diào)控腫瘤基因或者控制細胞增殖和循環(huán)[8-9]。目前已有若干LncRNAs被認為在惡性腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]，但具體作用機制仍不清楚。高通量RNA測序結(jié)果顯示LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET在膠質(zhì)瘤及其癌旁組織中的表達有顯著差異，且表達峰及穩(wěn)定性均較好，同時已有研究認為在膠質(zhì)瘤及其他若干腫瘤中LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET與癌癥的發(fā)生發(fā)展都具有密切的相關(guān)性[12-15]。為了進一步觀察LncRNAs對膠質(zhì)瘤的調(diào)控作用以及明確其表達是否和HHV-6A感染存在相關(guān)性，本研究選取與膠質(zhì)瘤發(fā)病相關(guān)性較強的LncRNA MEG3，同時驗證其表達與HHV-6A感染的相關(guān)性，并對病毒感染后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)等情況進行觀察，以揭示HHV-6A對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的可能調(diào)控方式。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

人星形膠質(zhì)細胞株HA-1800購自美國ATCC公司，U251、U87及U373等人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞購自中科院上海細胞庫，HHV-6A GS標準株及人急性淋巴母細胞白血病細胞(HSB-2)由南京醫(yī)科大學微生物與免疫實驗室保存提供。DMEM/F12培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，實時定量PCR試劑盒購自瑞士Roche公司，CCK-8試劑盒及RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司，Snail、E-cadherin、Vimentin及GAPDH等單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司，抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司，ECL顯影液購自美國Thermo公司。實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，流式細胞儀購自美國BD公司，倒置光學顯微鏡購自德國Zeiss公司。

1.2 臨床標本收集

實驗涉及的37例膠質(zhì)瘤組織、4例癌旁組織以及18例正常腦組織等人體標本均收集于南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)后(2017年1月—2018年1月)，患者年齡25～70歲。進一步統(tǒng)計膠質(zhì)瘤患者各臨床指標(性別、年齡、腫瘤大小及分級等)，并分析這些指標與膠質(zhì)瘤組織中LncRNA MEG3的表達高低是否有關(guān)系。所有樣品的采集均獲得腫瘤患者和志愿者的同意，且研究涉及的實驗獲南京醫(yī)科大學研究倫理委員會和江蘇省機構(gòu)審查委員會的批準。

1.3 實時定量PCR

在GenBank中搜索目的基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件輔助設(shè)計并結(jié)合文獻報道，最終篩選確定PCR引物序列：LncRNA MEG3，上游GAGTG TTTCCCTCCCCAAGG；下游GCGTGCCTTTGGTGATT CAG。LncRNA H19，上游TCAAGCCTGGGCCTTTG AAT； 下 游 CTGCTGTTCCGATGGTGTCT。 LncRNA LET，上游GTGACTCCCTCCAGATGTGC；下游ACTC TTGCCTTGGGAGTCCT。β-actin，上游 TGGCACCCA GCACAATGAA；下游CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA AGCA。收集臨床膠質(zhì)瘤組織及對應(yīng)癌旁組織或正常腦組織標本，提取組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，后續(xù)使用熒光實時定量PCR(qPCR)試劑盒配置20μL體系進行擴增，根據(jù)擴增曲線，由ABI 7500軟件系統(tǒng)嚴格分析獲CT得均值，以β-actin為內(nèi)參校正濃度差異引起的誤差，最終以 2-ΔΔCT法計算分析出各個樣本目的LncRNAs的相對表達水平。

1.4 細胞培養(yǎng)和病毒感染

取對數(shù)生長期的HSB-2細胞，以一定濃度(1×105/mL)種于6孔細胞培養(yǎng)板中，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。24 h后，在每孔中接種100 μL HHV-6A GS病毒液，當HSB-2細胞病變效應(yīng)大于80%時收集細胞懸液并測定病毒滴度(病毒滴度為各孔中CPE細胞平均數(shù)除以每孔中含有的病毒液體積)。根據(jù)所測定病毒滴度，用含2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基配置病毒懸液，用于感染人神經(jīng)膠質(zhì)瘤或人星形膠質(zhì)細胞(MOI=10)。后續(xù)選取HHV-6A病毒感染不同時間點(0、6、12、24及48 h)的正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞株HA-1800以及感染24 h的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U373，U251和SHG44細胞為實驗組，并以未經(jīng)感染的細胞作為對照組。分別提取感染組及對照組細胞RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同樣通過熒光實時定量PCR檢測分析感染前后各組細胞中LncRNA MEG3的表達變化。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖情況

選取LncRNA MEG3表達水平較高的膠質(zhì)瘤細胞U373進行HHV-6A的感染培養(yǎng)，并以未感染的正常U373細胞作為對照。收集病毒感染前后細胞，調(diào)整細胞密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板中(每孔1×103個)，加入胎牛血清，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)不同時間(24、48、72和96 h)取出培養(yǎng)板并在每孔細胞中加入10μL CCK-8溶液，再繼續(xù)孵育4 h后以測定吸光度D(450)值。以病毒感染組和對照組細胞的吸光度值為縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線，觀察細胞增殖情況。

1.6 細胞凋亡率檢測

收集HHV-6A感染24 h后及未感染的膠質(zhì)瘤細胞U373，PBS漂洗3次后按試劑盒說明分別加入Annexin V和碘化丙啶(propidium iodide，PI)，避光孵育染色后采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

1.7 劃痕實驗

將U373細胞接種在6孔板中，添加完全培養(yǎng)基使其生長至匯合，通過HHV-6A感染U373細胞。24 h后棄除培養(yǎng)基，并使用移液槍頭尖端刮擦細胞面產(chǎn)生劃痕。小心移除刮脫的細胞并添加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后通過倒置光學顯微鏡觀察病毒感染和未感染的細胞，使用Image J軟件計算分析感染組和對照組細胞劃痕的愈合程度(劃痕面積及傷口愈合比)，以觀察病毒感染前后U373細胞遷移能力的變化。

1.8 Western blot法檢測

分別取HHV-6A感染24 h后的U373細胞以及未感染病毒的對照組細胞，使用RIPA裂解液分別裂解病毒感染前后的細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50μg蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，后將蛋白印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，再分別加入一抗(兔抗人Snail、兔抗人E-cadherin、兔抗人Vimentin或兔抗人GAPDH)，4℃孵育過夜。洗除一抗后，添加HRP標記的羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，繼續(xù)孵育1 h。最后使用ECL法進行顯影檢測，并通過灰度掃描分析蛋白相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 6.0軟件統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)。膠質(zhì)瘤組織與癌旁組織/正常腦組織的LncRNA表達水平，病毒感染與對照組細胞增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)化等計量數(shù)據(jù)均以平均值±標準差形式表示，差異分析采用t檢驗。臨床計數(shù)資料通過例數(shù)表示，LncRNA MEG3表達高低分別與性別、年齡、腫瘤大小或腫瘤分級構(gòu)成兩組變量的四格表數(shù)據(jù)，均分別采用Fisher's卡方檢驗，而在已確認的HHV-6A陽性膠質(zhì)瘤患者中，LncRNA MEG3高低表達例數(shù)的差異應(yīng)用t檢驗分析，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織中相關(guān)LncRNAs的表達水平檢測

收集提取4例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的腫瘤及對應(yīng)癌旁組織RNA，通過qPCR分別測定其中LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET的表達水平。結(jié)果顯示，相對癌旁組織，腫瘤組織中僅LncRNA MEG3的表達明顯降低(圖1A)，LncRNA H19和LncRNA LET的表達差異無統(tǒng)計學意義(圖1B和圖1C)。進一步收集33例膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及18例正常腦組織，用qPCR檢測驗證其中LncRNA MEG3的表達水平。結(jié)果證實，LncRNA MEG3在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平顯著低于正常腦組織(P＜0.05，圖1D)。

臨床資料結(jié)果顯示LncRNA MEG3的表達高低與性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)，而LncRNA MEG3低表達的膠質(zhì)瘤患者構(gòu)成比在分級越高的患者中大于分級低的患者(P＜0.05)。同時，在HHV-6A感染相關(guān)的膠質(zhì)瘤中，LncRNA MEG3也更多地呈現(xiàn)出低表達趨勢(P＜0.05，表1)。

2.2 HHV-6A感染下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)細胞及膠質(zhì)瘤細胞LncRNA MEG3的表達水平

圖1 實時熒光定量PCR檢測膠質(zhì)瘤組織中相關(guān)LncRNAs的表達

表1 LncRNAMEG3表達與膠質(zhì)瘤患者臨床指標(n=33)

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，在HHV-6A感染HA-1800細胞6h后，該神經(jīng)膠質(zhì)細胞中LncRNAMEG3的表達即開始明顯減少(P＜0.01)，并隨著感染時間的延長而表達持續(xù)降低(圖2A)。此外，實時定量PCR結(jié)果同樣顯示，與未感染病毒的對照組細胞相比，在HHV-6A感染后24h，U373、U251和SHG44這3種膠質(zhì)瘤細胞株中LncRNAMEG3的表達水平較感染前顯著降低(P＜0.01)；而在未經(jīng)HHV-6A病毒感染的情況下，3種膠質(zhì)瘤細胞株中LncRNAMEG3的表達水平也明顯低于正常的膠質(zhì)細胞株(圖2B)。

2.3 HHV-6A感染對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響

圖2 實時熒光定量PCR檢測HHV-6A感染前后神經(jīng)膠質(zhì)及膠質(zhì)瘤細胞LncRNAMEG3的表達

CCK-8法檢測感染前后不同時間點(24、48、72和96h)膠質(zhì)瘤細胞U373的增殖情況，細胞生長曲線顯示，與未感染病毒的對照組細胞相比，在病毒感染48h時U373細胞的生長曲線有所升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3A)。Annexin V/PI雙染色及流式分析結(jié)果顯示：HHV-6感染后U373細胞的凋亡率[(6.05±0.40)%]顯著低于未感染組細胞[(8.23±0.75)%]，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3B和3C)。

圖3 HHV-6A感染后U373細胞增殖及凋亡檢測

2.4 HHV-6A感染促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲與EMT

通過細胞劃痕實驗觀察病毒感染(24 h)后膠質(zhì)瘤細胞U373的遷移能力，結(jié)果見圖4。顯示未感染病毒的對照組細胞劃痕愈合度為(43.67±6.30)%，病毒感染后U373細胞劃痕愈合度為(72.33±6.90)%，提示病毒感染后U373細胞侵襲能力較未感染細胞增強(P＜0.05)。

圖4 劃痕實驗觀察HHV-6A感染后U373細胞的侵襲情況

在HHV-6A感染U373細胞24 h后，通過Western blot檢測感染前后U373細胞中Snail、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達水平并做統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，病毒感染后U373細胞中Snail及Vimentin蛋白的表達升高，而E-cadherin蛋白的表達降低(P＜0.05，圖5)，提示HHV-6A感染可能促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

3 討論

眾多研究認為HHV-6與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如多發(fā)性硬化、癲癇以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[16]。與正常腦組織相比，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中可檢測到較高陽性率的HHV-6 DNA、早期蛋白以及晚期蛋白，同時在神經(jīng)膠質(zhì)瘤囊液中也能分離到HHV-6A病毒，這些研究結(jié)果均提示HHV-6和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關(guān)[6，17]，但其具體作用機制仍然不是很清楚。

圖5 Western b lot檢測HHV-6A感染后U373細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標蛋白

LncRNA MEG3已被證實在多種腫瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用[12，18]。本研究發(fā)現(xiàn)：與癌旁或正常腦組織相比，LncRNA MEG3在膠質(zhì)瘤組織中表達明顯降低，且膠質(zhì)瘤細胞株中LncRNA MEG3的表達也較正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞株低，借此推斷MEG3表達降低可能導致或促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生。值得注意的是，LncRNA MEG3低表達的膠質(zhì)瘤組織顯示出更高的HHV-6A陽性率。體外感染細胞實驗顯示HHV-6A感染同樣可使膠質(zhì)瘤細胞中LncRNA MEG3的表達持續(xù)下調(diào)，因此提示HHV-6A感染可能是引起LncRNA MEG3的表達下調(diào)，并進一步促進膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要原因之一。

LncRNA被認為可通過調(diào)控細胞增殖、凋亡、遷移和EMT等功能來影響癌癥的發(fā)生。EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中扮演著十分重要的角色，其主要的特征是上皮細胞連接蛋白如E-cadherin的喪失、間充質(zhì)標記物如Vimentin的增加和細胞骨架重組等[19]。Snail蛋白家族是一類非常不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄因子，對翻譯后修飾很敏感，可通過羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域與E盒的DNA序列結(jié)合來抑制上皮細胞相關(guān)基因的表達，從而在EMT的發(fā)生和調(diào)控中扮演著重要的角色，MAPK的激活可直接上調(diào)Snail表達，并觸發(fā)PI3K等信號誘導EMT發(fā)生[20]。本研究在明確HHV-6A感染可以下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞LncRNA MEG3的基礎(chǔ)上，進一步發(fā)現(xiàn)HHV-6A感染可以促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲能力，并抑制其凋亡。同時，病毒的感染也加快了其EMT進程。ZHANG L等人[21]發(fā)現(xiàn)過表達LncRNA MEG3可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251的增殖，并促進其凋亡。動物實驗也表明LncRNA MEG3的高表達可以抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生及進展。此外，QIN等人[14]也證實了MEG3可作為miR-19a的競爭性內(nèi)源性RNA來抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，遷移和侵襲。雖然下調(diào)LncRNA MEG3的表達可能只是HHV-6A促進膠質(zhì)瘤發(fā)生的諸多調(diào)控機制之一，且其下游的具體信號通路仍需要深入探索，但這些結(jié)果為進一步研究HHV-6A在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及其他相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機制研究提供了新的思路。