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        HHV-6A感染對神經(jīng)膠質瘤細胞Ln cRNA M EG 3表達及增殖凋亡侵襲轉化的影響

        2019-10-10 06:08:06金佩佩
        癌變·畸變·突變 2019年5期
        關鍵詞:細胞株病毒感染膠質瘤

        萬 昕,胡 月,章 菊,陳 云,金佩佩,*

        (1.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院檢驗科,安徽 合肥 230036;2.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心,安徽 合肥 230036;3.南京醫(yī)科大學微生物與免疫學系,江蘇 南京 211100)

        神經(jīng)膠質瘤是大腦中最常見的原發(fā)性腫瘤,約占所有腦惡性腫瘤的50%~60%[1]。傳統(tǒng)治療惡性腦膠質瘤的首選方法是手術切除,再輔以化療、放療或綜合放化療,但是膠質瘤的發(fā)病機制復雜,加之其侵襲性生長等特性都使得臨床治療策略受到很大限制[2-4]。因此,進一步了解膠質瘤相關發(fā)病機制顯得尤為重要。

        最新研究提示病毒也可能是神經(jīng)膠質瘤的重要誘發(fā)因素。人類皰疹病毒6型(human herpesvirus 6,HHV-6)是一類嗜人淋巴細胞雙鏈DNA病毒,可分為A和B兩個亞型[5]。其中HHV-6A亞型被認為與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括神經(jīng)膠質瘤存在相關性[6]。在膠質瘤組織中可檢測到高百分比的HHV-6A核酸及蛋白質成分,同時HHV-6A感染也可上調星形膠質細胞分泌促炎細胞因子[7]。眾多研究顯示HHV-6A可能是一種影響膠質瘤發(fā)生發(fā)展的重要潛在病原體,但是其具體的致病或調控機制還有待進一步探索和驗證。

        長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA,它通過多種途徑調控腫瘤基因或者控制細胞增殖和循環(huán)[8-9]。目前已有若干LncRNAs被認為在惡性腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調節(jié)作用[10-11],但具體作用機制仍不清楚。高通量RNA測序結果顯示LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET在膠質瘤及其癌旁組織中的表達有顯著差異,且表達峰及穩(wěn)定性均較好,同時已有研究認為在膠質瘤及其他若干腫瘤中LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET與癌癥的發(fā)生發(fā)展都具有密切的相關性[12-15]。為了進一步觀察LncRNAs對膠質瘤的調控作用以及明確其表達是否和HHV-6A感染存在相關性,本研究選取與膠質瘤發(fā)病相關性較強的LncRNA MEG3,同時驗證其表達與HHV-6A感染的相關性,并對病毒感染后神經(jīng)膠質瘤細胞增殖、凋亡及上皮間充質轉化(epithelialmesenchymal transition,EMT)等情況進行觀察,以揭示HHV-6A對膠質瘤發(fā)生發(fā)展的可能調控方式。

        1 材料與方法

        1.1 細胞、試劑和儀器

        人星形膠質細胞株HA-1800購自美國ATCC公司,U251、U87及U373等人神經(jīng)膠質瘤細胞購自中科院上海細胞庫,HHV-6A GS標準株及人急性淋巴母細胞白血病細胞(HSB-2)由南京醫(yī)科大學微生物與免疫實驗室保存提供。DMEM/F12培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司,RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司,實時定量PCR試劑盒購自瑞士Roche公司,CCK-8試劑盒及RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司,Annexin V/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司,Snail、E-cadherin、Vimentin及GAPDH等單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司,抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司,ECL顯影液購自美國Thermo公司。實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司,流式細胞儀購自美國BD公司,倒置光學顯微鏡購自德國Zeiss公司。

        1.2 臨床標本收集

        實驗涉及的37例膠質瘤組織、4例癌旁組織以及18例正常腦組織等人體標本均收集于南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術后(2017年1月—2018年1月),患者年齡25~70歲。進一步統(tǒng)計膠質瘤患者各臨床指標(性別、年齡、腫瘤大小及分級等),并分析這些指標與膠質瘤組織中LncRNA MEG3的表達高低是否有關系。所有樣品的采集均獲得腫瘤患者和志愿者的同意,且研究涉及的實驗獲南京醫(yī)科大學研究倫理委員會和江蘇省機構審查委員會的批準。

        1.3 實時定量PCR

        在GenBank中搜索目的基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件輔助設計并結合文獻報道,最終篩選確定PCR引物序列:LncRNA MEG3,上游GAGTG TTTCCCTCCCCAAGG;下游GCGTGCCTTTGGTGATT CAG。LncRNA H19,上游TCAAGCCTGGGCCTTTG AAT; 下 游 CTGCTGTTCCGATGGTGTCT。 LncRNA LET,上游GTGACTCCCTCCAGATGTGC;下游ACTC TTGCCTTGGGAGTCCT。β-actin,上游 TGGCACCCA GCACAATGAA;下游CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA AGCA。收集臨床膠質瘤組織及對應癌旁組織或正常腦組織標本,提取組織總RNA并反轉錄為cDNA,后續(xù)使用熒光實時定量PCR(qPCR)試劑盒配置20μL體系進行擴增,根據(jù)擴增曲線,由ABI 7500軟件系統(tǒng)嚴格分析獲CT得均值,以β-actin為內參校正濃度差異引起的誤差,最終以 2-ΔΔCT法計算分析出各個樣本目的LncRNAs的相對表達水平。

        1.4 細胞培養(yǎng)和病毒感染

        取對數(shù)生長期的HSB-2細胞,以一定濃度(1×105/mL)種于6孔細胞培養(yǎng)板中,加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。24 h后,在每孔中接種100 μL HHV-6A GS病毒液,當HSB-2細胞病變效應大于80%時收集細胞懸液并測定病毒滴度(病毒滴度為各孔中CPE細胞平均數(shù)除以每孔中含有的病毒液體積)。根據(jù)所測定病毒滴度,用含2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基配置病毒懸液,用于感染人神經(jīng)膠質瘤或人星形膠質細胞(MOI=10)。后續(xù)選取HHV-6A病毒感染不同時間點(0、6、12、24及48 h)的正常神經(jīng)膠質細胞株HA-1800以及感染24 h的神經(jīng)膠質瘤細胞株U373,U251和SHG44細胞為實驗組,并以未經(jīng)感染的細胞作為對照組。分別提取感染組及對照組細胞RNA并反轉錄為cDNA,同樣通過熒光實時定量PCR檢測分析感染前后各組細胞中LncRNA MEG3的表達變化。

        1.5 CCK-8法檢測細胞增殖情況

        選取LncRNA MEG3表達水平較高的膠質瘤細胞U373進行HHV-6A的感染培養(yǎng),并以未感染的正常U373細胞作為對照。收集病毒感染前后細胞,調整細胞密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板中(每孔1×103個),加入胎牛血清,置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)不同時間(24、48、72和96 h)取出培養(yǎng)板并在每孔細胞中加入10μL CCK-8溶液,再繼續(xù)孵育4 h后以測定吸光度D(450)值。以病毒感染組和對照組細胞的吸光度值為縱坐標,以培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線,觀察細胞增殖情況。

        1.6 細胞凋亡率檢測

        收集HHV-6A感染24 h后及未感染的膠質瘤細胞U373,PBS漂洗3次后按試劑盒說明分別加入Annexin V和碘化丙啶(propidium iodide,PI),避光孵育染色后采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

        1.7 劃痕實驗

        將U373細胞接種在6孔板中,添加完全培養(yǎng)基使其生長至匯合,通過HHV-6A感染U373細胞。24 h后棄除培養(yǎng)基,并使用移液槍頭尖端刮擦細胞面產(chǎn)生劃痕。小心移除刮脫的細胞并添加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),24 h后通過倒置光學顯微鏡觀察病毒感染和未感染的細胞,使用Image J軟件計算分析感染組和對照組細胞劃痕的愈合程度(劃痕面積及傷口愈合比),以觀察病毒感染前后U373細胞遷移能力的變化。

        1.8 Western blot法檢測

        分別取HHV-6A感染24 h后的U373細胞以及未感染病毒的對照組細胞,使用RIPA裂解液分別裂解病毒感染前后的細胞,提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取50μg蛋白進行10%SDS-PAGE電泳,后將蛋白印跡轉移到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h,再分別加入一抗(兔抗人Snail、兔抗人E-cadherin、兔抗人Vimentin或兔抗人GAPDH),4℃孵育過夜。洗除一抗后,添加HRP標記的羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋),繼續(xù)孵育1 h。最后使用ECL法進行顯影檢測,并通過灰度掃描分析蛋白相對表達水平。

        1.9 統(tǒng)計學方法

        使用GraphPad Prism 6.0軟件統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)。膠質瘤組織與癌旁組織/正常腦組織的LncRNA表達水平,病毒感染與對照組細胞增殖凋亡及侵襲轉化等計量數(shù)據(jù)均以平均值±標準差形式表示,差異分析采用t檢驗。臨床計數(shù)資料通過例數(shù)表示,LncRNA MEG3表達高低分別與性別、年齡、腫瘤大小或腫瘤分級構成兩組變量的四格表數(shù)據(jù),均分別采用Fisher's卡方檢驗,而在已確認的HHV-6A陽性膠質瘤患者中,LncRNA MEG3高低表達例數(shù)的差異應用t檢驗分析,P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 膠質瘤組織中相關LncRNAs的表達水平檢測

        收集提取4例神經(jīng)膠質瘤患者的腫瘤及對應癌旁組織RNA,通過qPCR分別測定其中LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET的表達水平。結果顯示,相對癌旁組織,腫瘤組織中僅LncRNA MEG3的表達明顯降低(圖1A),LncRNA H19和LncRNA LET的表達差異無統(tǒng)計學意義(圖1B和圖1C)。進一步收集33例膠質瘤患者腫瘤組織及18例正常腦組織,用qPCR檢測驗證其中LncRNA MEG3的表達水平。結果證實,LncRNA MEG3在膠質瘤組織中的表達水平顯著低于正常腦組織(P<0.05,圖1D)。

        臨床資料結果顯示LncRNA MEG3的表達高低與性別、年齡及腫瘤大小無關,而LncRNA MEG3低表達的膠質瘤患者構成比在分級越高的患者中大于分級低的患者(P<0.05)。同時,在HHV-6A感染相關的膠質瘤中,LncRNA MEG3也更多地呈現(xiàn)出低表達趨勢(P<0.05,表1)。

        2.2 HHV-6A感染下調神經(jīng)膠質細胞及膠質瘤細胞LncRNA MEG3的表達水平

        圖1 實時熒光定量PCR檢測膠質瘤組織中相關LncRNAs的表達

        表1 LncRNAMEG3表達與膠質瘤患者臨床指標(n=33)

        實時熒光定量PCR結果顯示,與對照組相比,在HHV-6A感染HA-1800細胞6h后,該神經(jīng)膠質細胞中LncRNAMEG3的表達即開始明顯減少(P<0.01),并隨著感染時間的延長而表達持續(xù)降低(圖2A)。此外,實時定量PCR結果同樣顯示,與未感染病毒的對照組細胞相比,在HHV-6A感染后24h,U373、U251和SHG44這3種膠質瘤細胞株中LncRNAMEG3的表達水平較感染前顯著降低(P<0.01);而在未經(jīng)HHV-6A病毒感染的情況下,3種膠質瘤細胞株中LncRNAMEG3的表達水平也明顯低于正常的膠質細胞株(圖2B)。

        2.3 HHV-6A感染對神經(jīng)膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響

        圖2 實時熒光定量PCR檢測HHV-6A感染前后神經(jīng)膠質及膠質瘤細胞LncRNAMEG3的表達

        CCK-8法檢測感染前后不同時間點(24、48、72和96h)膠質瘤細胞U373的增殖情況,細胞生長曲線顯示,與未感染病毒的對照組細胞相比,在病毒感染48h時U373細胞的生長曲線有所升高,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3A)。Annexin V/PI雙染色及流式分析結果顯示:HHV-6感染后U373細胞的凋亡率[(6.05±0.40)%]顯著低于未感染組細胞[(8.23±0.75)%],差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3B和3C)。

        圖3 HHV-6A感染后U373細胞增殖及凋亡檢測

        2.4 HHV-6A感染促進神經(jīng)膠質瘤細胞的侵襲與EMT

        通過細胞劃痕實驗觀察病毒感染(24 h)后膠質瘤細胞U373的遷移能力,結果見圖4。顯示未感染病毒的對照組細胞劃痕愈合度為(43.67±6.30)%,病毒感染后U373細胞劃痕愈合度為(72.33±6.90)%,提示病毒感染后U373細胞侵襲能力較未感染細胞增強(P<0.05)。

        圖4 劃痕實驗觀察HHV-6A感染后U373細胞的侵襲情況

        在HHV-6A感染U373細胞24 h后,通過Western blot檢測感染前后U373細胞中Snail、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達水平并做統(tǒng)計分析。結果顯示,病毒感染后U373細胞中Snail及Vimentin蛋白的表達升高,而E-cadherin蛋白的表達降低(P<0.05,圖5),提示HHV-6A感染可能促進神經(jīng)膠質瘤細胞的上皮-間質轉化。

        3 討論

        眾多研究認為HHV-6與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展相關,如多發(fā)性硬化、癲癇以及神經(jīng)膠質瘤等[16]。與正常腦組織相比,在神經(jīng)膠質瘤組織中可檢測到較高陽性率的HHV-6 DNA、早期蛋白以及晚期蛋白,同時在神經(jīng)膠質瘤囊液中也能分離到HHV-6A病毒,這些研究結果均提示HHV-6和人神經(jīng)膠質瘤有關[6,17],但其具體作用機制仍然不是很清楚。

        圖5 Western b lot檢測HHV-6A感染后U373細胞上皮間質轉化指標蛋白

        LncRNA MEG3已被證實在多種腫瘤包括神經(jīng)膠質瘤發(fā)展過程中起著重要的調控作用[12,18]。本研究發(fā)現(xiàn):與癌旁或正常腦組織相比,LncRNA MEG3在膠質瘤組織中表達明顯降低,且膠質瘤細胞株中LncRNA MEG3的表達也較正常神經(jīng)膠質細胞株低,借此推斷MEG3表達降低可能導致或促進膠質瘤的發(fā)生。值得注意的是,LncRNA MEG3低表達的膠質瘤組織顯示出更高的HHV-6A陽性率。體外感染細胞實驗顯示HHV-6A感染同樣可使膠質瘤細胞中LncRNA MEG3的表達持續(xù)下調,因此提示HHV-6A感染可能是引起LncRNA MEG3的表達下調,并進一步促進膠質瘤發(fā)生的重要原因之一。

        LncRNA被認為可通過調控細胞增殖、凋亡、遷移和EMT等功能來影響癌癥的發(fā)生。EMT在腫瘤侵襲和轉移的過程中扮演著十分重要的角色,其主要的特征是上皮細胞連接蛋白如E-cadherin的喪失、間充質標記物如Vimentin的增加和細胞骨架重組等[19]。Snail蛋白家族是一類非常不穩(wěn)定的轉錄因子,對翻譯后修飾很敏感,可通過羧基末端的鋅指結構域與E盒的DNA序列結合來抑制上皮細胞相關基因的表達,從而在EMT的發(fā)生和調控中扮演著重要的角色,MAPK的激活可直接上調Snail表達,并觸發(fā)PI3K等信號誘導EMT發(fā)生[20]。本研究在明確HHV-6A感染可以下調膠質瘤細胞LncRNA MEG3的基礎上,進一步發(fā)現(xiàn)HHV-6A感染可以促進膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力,并抑制其凋亡。同時,病毒的感染也加快了其EMT進程。ZHANG L等人[21]發(fā)現(xiàn)過表達LncRNA MEG3可以抑制神經(jīng)膠質瘤細胞U251的增殖,并促進其凋亡。動物實驗也表明LncRNA MEG3的高表達可以抑制膠質瘤的發(fā)生及進展。此外,QIN等人[14]也證實了MEG3可作為miR-19a的競爭性內源性RNA來抑制膠質瘤細胞的增殖,遷移和侵襲。雖然下調LncRNA MEG3的表達可能只是HHV-6A促進膠質瘤發(fā)生的諸多調控機制之一,且其下游的具體信號通路仍需要深入探索,但這些結果為進一步研究HHV-6A在人神經(jīng)膠質瘤以及其他相關中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機制研究提供了新的思路。

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