馬 陽，吳 娟，紀(jì)曉坤，王 蕊，杜 蕓*，王 珩，郭 曉，張 艷

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心，河北 石家莊 050011)

肺癌是我國現(xiàn)階段發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人們的生命，其中非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)占肺癌類型的85%～90%。對于晚期非小細(xì)胞肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者，放療、化療等非手術(shù)治療常對機體有害，降低了患者的生活質(zhì)量，且療效有限[1]。因此，探索肺癌發(fā)生的機制，對于肺癌患者尋找新的治療方法具有重要意義。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是屬于酪氨酸激酶型受體，EGFR可與細(xì)胞外配體，例如表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，結(jié)合形成二聚體，啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞正?；顒樱ㄟ^細(xì)胞質(zhì)內(nèi)銜接蛋白和酶的級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因，影響細(xì)胞增殖、分化、遷移、黏附及凋亡[2-4]。而在腫瘤細(xì)胞中，EGFR基因通常發(fā)生過表達(dá)或突變，引起酪氨酸活化后，會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活、增生、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明EGFR過表達(dá)在NSCLC細(xì)胞很常見，并且與預(yù)后不良和化療耐藥密切相關(guān)[5-7]。

自噬(autophagy)同樣廣泛存在于人體的細(xì)胞中，參與各種生理病理過程，細(xì)胞自噬過程可以降解一些蛋白與細(xì)胞器供細(xì)胞循環(huán)利用，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[8]。自噬活動及其相關(guān)基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1-light chain 3，MAP1-LC3)是參與自噬小體形成的重要蛋白，定位于自噬泡和自噬泡表面，參與自噬體的形成，是目前觀察自噬現(xiàn)象是否存在及自噬活性最為可靠的生物學(xué)指標(biāo)[9]。為此，我們通過轉(zhuǎn)染體外特異性siRNA來沉默肺腺癌細(xì)胞A549的表皮生長因子受體EGFR的表達(dá)，研究其對細(xì)胞自噬活性的影響，為探索肺腺癌病理生理機制提供理論基礎(chǔ)，為肺腺癌臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞株A549由河北醫(yī)科大學(xué)病理研究室提供；OPTI培養(yǎng)液、Lipofectamine?RNAiMAX Reagent和小干擾RNA均購于Invitrogengon公司；Real-time RT-PCR試劑盒購于Promega公司；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購于北京Solarbio科技技術(shù)有限公司；鼠抗人LC3單克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體、β-actin抗體及HRP標(biāo)記的抗鼠二抗均購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，用0.25%的胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 EGF處理A549細(xì)胞 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，按2×105個/mL的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，分為4個組，分別為未處理組和EGF 10、25、50 ng/mL處理組，待作用24 h后檢測EGFR蛋白的表達(dá)水平。

1.2.3 肺腺癌細(xì)胞EGFR siRNA瞬時轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞按2×105個/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿90%～95%孔底面積時，更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。將100μL無血清OPTI培養(yǎng)液與7.5μL Lipofectamine?RNAiMAX Reagent加入無菌EP管中輕輕混勻，100 μL無血清OPTI培養(yǎng)液與原濃度為20μmol/L的EGFR特異性siRNA 5μL在另一無菌EP管中輕輕混勻后，將2個管移入1個EP管中再輕輕混勻，靜置5 min，兩者混合制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫靜置25 min形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液，加入對應(yīng)孔板中(在這一過程中動作輕柔，切忌劇烈震蕩)。以空質(zhì)粒載體組作為陰性對照。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，實驗分為陰性對照組、EGFR siRNA-1組、EGFR siRNA-2組和EGFR siRNA-3組，分別采用Realtime RT-PCR和Western blot方法檢測EGFR mRNA和蛋白表達(dá)水平來評價3個siRNA的沉默效果。

1.2.4 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光PCR

Trizol法提取總RNA，具體步驟見Trizol總RNA抽提試劑盒說明書；逆轉(zhuǎn)錄SYBR Green及實時熒光PCR步驟見試劑說明書。GAPDH引物序列：上游5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′， 下 游 5′-CCTTC TCCATGGTGGTGAAGAC-3′；EGFR引物序列：上游5′-GTGACCGTTTGGGAGTTGAT-3′， 下 游 5′-GGGC GACTATCTGCGTCTAT-3′；GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.5 Western blot法檢測 利用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用以檢測EGFR蛋白表達(dá)，蛋白濃度測定后，按每孔20μL上樣量用Loading Buffer配平，沸水加熱后上樣，行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。經(jīng)洗滌后，加入一抗(鼠抗人EGFR抗體1∶1 000稀釋，鼠抗人LC3抗體1∶2 000稀釋，β-actin抗體1∶5 000稀釋)，37℃孵育1h后4℃過夜；PBST洗滌后加入二抗(HRP標(biāo)記的抗鼠二抗1∶5 000稀釋)。洗滌膜后，利用Easy See化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光，顯影。用Image Tool測量目的蛋白條帶盒內(nèi)參條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.6 沉默EGFR表達(dá)后檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá) A549細(xì)胞分為4組：EGFR siRNA組，空載體組，轉(zhuǎn)染試劑組(加入轉(zhuǎn)染試劑)和空白對照組。4組同時加入等量濃度為50 ng/mL EGF處理24 h后，收集細(xì)胞。Western blot方法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況。

1.2.7 透射電子顯微鏡觀察自噬小體 A549細(xì)胞分為2組：EGFR siRNA組和空載體組。用配制好2.5%戊二醛固定液固定各組細(xì)胞，放入4℃冰箱保存，且無劇烈晃動，固定至少1 h后送電鏡室。用1/15 mol/L的磷酸緩沖液洗滌標(biāo)本3次，每次約15 min；用1%四氧鋨酸固定標(biāo)本1～2 h，4℃冰箱保存；用磷酸緩沖液再次洗滌標(biāo)本3次，每次約15 min；經(jīng)50%、70%、80%、90%的丙酮濃度梯度脫水，各1次，約15 min，100%丙酮浸入15 min，2次；包埋劑浸透3 h，室溫或過夜：100%丙酮與包埋液比例為1∶1，37℃、60 min；100%丙酮與包埋液比例為1∶3，37℃、過夜；純包埋液浸透37℃、5 h。用環(huán)氧樹脂把標(biāo)本包埋在包埋板或者膠囊中，然后依次置于37℃、24 h；60℃、48 h，進行聚合；用超薄切片機靶標(biāo)被切成超薄切片，厚約50 nm，接著用醋酸雙氧鈾染色30～45 min，檸檬酸鉛染色5～30 min，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體情況。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗結(jié)果用xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗或Wilcoxon符號秩檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 EGFR蛋白表達(dá)水平

在肺腺癌A549細(xì)胞中加入不同濃度的EGF，用Western blot法檢測EGFR蛋白的相對表達(dá)水平，結(jié)果見圖1，可見未處理組和10、25、50 ng/mL EGF處理組的EGFR蛋白相對表達(dá)水平分別為0.42±0.02和0.55±0.03、0.94±0.04、4.34±0.16，顯示EGFR蛋白的表達(dá)水平隨EGF濃度的增加而升高。

圖1 不同濃度EGF處理肺腺癌A549細(xì)胞后EGFR蛋白表達(dá)

2.2 特異性EGFR siRNA對EGFR蛋白表達(dá)的沉默效應(yīng)

Western blot檢測結(jié)果見圖2，陰性對照組以及轉(zhuǎn)染EGFR siRNA-1、EGFR siRNA-2、EGFR siRNA-3后，肺腺癌A549細(xì)胞EGFR蛋白相對表達(dá)水平分別為0.67±0.02、0.30±0.02、0.63±0.07、0.56±0.03。用Real-time RT-PCR法檢測陰性對照組與EGFR siRNA-1組細(xì)胞的EGFR mRNA表達(dá)水平，結(jié)果見圖3，顯示分別為1.06±0.24、0.10±0.01，表明siRNA-1可明顯降低EGFR表達(dá)(P均＜0.05)，因此采用EGFR siRNA-1進行后續(xù)實驗。

圖2 Western b lot方法檢測siRNA對A549細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)的沉默效果

圖3 Real-time RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染EGFR siRNA-1后A549細(xì)胞EGFR m RNA的表達(dá)

2.3 EGFR siRNA對肺腺癌A549細(xì)胞的自噬效應(yīng)分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測轉(zhuǎn)染EGFR siRNA后A549細(xì)胞自噬效應(yīng)分子LC3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見圖4，顯示轉(zhuǎn)染EGFR siRNA組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比例高于其他3組(P＜0.05)；空載體組，轉(zhuǎn)染試劑組(加入轉(zhuǎn)染試劑)和空白對照組細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比例無明顯差異(P＞0.05)。實驗表明抑制EGFR表達(dá)可以提高肺腺癌A549細(xì)胞自噬活性。

圖4 Westernblot方法檢測不同處理組A549細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)

2.4 A549細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染EGFRsiRNA后自噬小體的變化情況

電鏡觀察結(jié)果見圖5，在電鏡視野下，自噬小體為雙層或多層膜的球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等?？梢娤啾瓤蛰d體組，EGFR siRNA組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量顯著增多?？梢姵聊珽GFR基因后，經(jīng)電鏡直觀顯示A549細(xì)胞自噬活性升高。

3 討論

本實驗研究表明，首先，應(yīng)用特異性EGFR siRNA可以在RNA水平和蛋白水平有效降低表皮生長因子受體EGFR的表達(dá)量，成功實現(xiàn)EGFR基因轉(zhuǎn)錄后沉默效應(yīng)。其次，在加入表皮生長因子EGF條件下，通過特異性EGFRsiRNA干擾技術(shù)降低EGFR表達(dá)，實驗通過抑制EGFR表達(dá)可以提高肺腺癌A549細(xì)胞自噬活性，會誘導(dǎo)自噬活性的增加。WEI[10]等通過EGF刺激及血清饑餓處理兩項條件下已有證實增強EGFR信號通路可以降低細(xì)胞自噬的活性。而我們通過應(yīng)用特異性siRNA干擾技術(shù)，逆向證明降低EGFR表達(dá)量，可以誘導(dǎo)自噬增加。再次，我們通過透射電子顯微鏡更加直觀的觀察，在加入EGF處理下，EGFRsiRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量雙層杯狀膜包裹的細(xì)胞內(nèi)容物的自噬小體。

圖5 透射電子顯微鏡顯示A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)是非常重要的生物學(xué)研究工具，并且在基因治療方面表現(xiàn)出巨大的潛力[11]。研究表明RNAi包括兩個關(guān)鍵的部分：siRNA的合成和iRNA與沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合來介導(dǎo)RISC地靶mRNA的切割，最終誘發(fā)放大沉默信號，進而關(guān)閉相關(guān)的蛋白表達(dá)[12-15]。本實驗中應(yīng)用特異性EGFRsiRNA可以在RNA水平和蛋白水平有效降低表皮生長因子受體EGFR的表達(dá)量，成功實現(xiàn)EGFR基因轉(zhuǎn)錄后沉默效應(yīng)。

EGFR是一種廣泛分布于機體各組織細(xì)胞膜上的多功能跨膜糖蛋白，可與EGF結(jié)合形成二聚體發(fā)生交聯(lián)磷酸化，待激活細(xì)胞內(nèi)TK區(qū)后會激活以下信號通路傳導(dǎo)：Ras/MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路、STAT信號通路和Beclin1信號通路[16]。配體EGF對EGFR信號通路內(nèi)在化作用有明顯的影響。KUMA[17]等研究表明，在不同劑量EGF的誘導(dǎo)會導(dǎo)致EGFR復(fù)合物內(nèi)在化的途徑和效果不同。因此在實驗中選擇不同濃度梯度的EGF，對細(xì)胞進行處理，結(jié)果顯示隨著EGF濃度升高，EGFR表達(dá)呈濃度依賴性升高。

另一方面，細(xì)胞自噬是胞漿內(nèi)長壽蛋白和多余的細(xì)胞器通過自噬作用被包裹形成自噬小體，消化降解為氨基酸、脂肪酸等供細(xì)胞循環(huán)利用，重新合成大分子有機物和ATP，進而維持細(xì)胞的正常代謝[18]。自噬相關(guān)蛋白LC3可分為三種亞型，其中LC3B亞型與自噬關(guān)系最為密切。通常我們對LC3的檢測即對LC3B的檢測。一般情況下，細(xì)胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯合成的LC3經(jīng)過加工，會形成LC3-Ⅰ；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾，進而與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，便形成LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上，則意味著自噬小體的最終形成，因此，LC3-Ⅱ的含量與自噬泡的數(shù)量(即自噬的活性)呈正比[19-20]。細(xì)胞自噬與許多疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，尤其是自噬作用及自噬因子的調(diào)節(jié)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。細(xì)胞自噬與許多疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。自噬可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境的關(guān)系來促進腫瘤的生長[21-22]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于低氧等壓力環(huán)境時，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α)和 BCL2/腺病毒EIB19kd結(jié)合蛋白(BCL-2/adenovirus EIB 19kdinteracting protein 3，BNIP3)被激活，阻止BCL-2和Beclin1的相互作用，從而激活自噬通路來促進腫瘤細(xì)胞對于低氧的應(yīng)對能力[21-23]。另一方面，自噬對腫瘤也有抑制作用，自噬的異?？蓪?dǎo)致多種抑癌基因的失活和癌基因的激活，有研究顯示小鼠模型的胰腺細(xì)胞經(jīng)致癌物誘導(dǎo)后，所形成的癌前病灶及腺瘤的自噬能力增加，但當(dāng)癌細(xì)胞形成后自噬活性就會下降[24]。此外，在Braf誘發(fā)的肺癌模型以及Atg7沉默的腫瘤模型中會出現(xiàn)脂代謝受損，對于缺乏自噬活性的腫瘤細(xì)胞來說，會降低其處理調(diào)節(jié)營養(yǎng)缺失的能力[25]。由此可見，自噬不僅對細(xì)胞正常生理狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用，同時也對腫瘤細(xì)胞有雙重作用，并且對腫瘤細(xì)胞的代謝有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，在腫瘤細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)EGFR基因表達(dá)，經(jīng)下游信號通路傳導(dǎo)后，最終對自噬活性有明顯的影響，但由于自噬對腫瘤細(xì)胞作用較為復(fù)雜，需要更深入全面的研究，才能更能明確了解自噬與EGFR信號通路在肺腺癌病理生理機制，進而為肺腺癌臨床治療提供理論基礎(chǔ)。