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        沉默表皮生長因子受體的表達(dá)對(duì)肺腺癌A 549細(xì)胞自噬的影響

        2019-10-10 06:08:06紀(jì)曉坤
        癌變·畸變·突變 2019年5期
        關(guān)鍵詞:小體生長因子腺癌

        馬 陽,吳 娟,紀(jì)曉坤,王 蕊,杜 蕓*,王 珩,郭 曉,張 艷

        (河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心,河北 石家莊 050011)

        肺癌是我國現(xiàn)階段發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著人們的生命,其中非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)占肺癌類型的85%~90%。對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者,放療、化療等非手術(shù)治療常對(duì)機(jī)體有害,降低了患者的生活質(zhì)量,且療效有限[1]。因此,探索肺癌發(fā)生的機(jī)制,對(duì)于肺癌患者尋找新的治療方法具有重要意義。

        表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是屬于酪氨酸激酶型受體,EGFR可與細(xì)胞外配體,例如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF),結(jié)合形成二聚體,啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)細(xì)胞正常活動(dòng),通過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)銜接蛋白和酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因,影響細(xì)胞增殖、分化、遷移、黏附及凋亡[2-4]。而在腫瘤細(xì)胞中,EGFR基因通常發(fā)生過表達(dá)或突變,引起酪氨酸活化后,會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活、增生、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明EGFR過表達(dá)在NSCLC細(xì)胞很常見,并且與預(yù)后不良和化療耐藥密切相關(guān)[5-7]。

        自噬(autophagy)同樣廣泛存在于人體的細(xì)胞中,參與各種生理病理過程,細(xì)胞自噬過程可以降解一些蛋白與細(xì)胞器供細(xì)胞循環(huán)利用,從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[8]。自噬活動(dòng)及其相關(guān)基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1-light chain 3,MAP1-LC3)是參與自噬小體形成的重要蛋白,定位于自噬泡和自噬泡表面,參與自噬體的形成,是目前觀察自噬現(xiàn)象是否存在及自噬活性最為可靠的生物學(xué)指標(biāo)[9]。為此,我們通過轉(zhuǎn)染體外特異性siRNA來沉默肺腺癌細(xì)胞A549的表皮生長因子受體EGFR的表達(dá),研究其對(duì)細(xì)胞自噬活性的影響,為探索肺腺癌病理生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ),為肺腺癌臨床治療提供新的思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        人肺腺癌細(xì)胞株A549由河北醫(yī)科大學(xué)病理研究室提供;OPTI培養(yǎng)液、Lipofectamine?RNAiMAX Reagent和小干擾RNA均購于Invitrogengon公司;Real-time RT-PCR試劑盒購于Promega公司;總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購于北京Solarbio科技技術(shù)有限公司;鼠抗人LC3單克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體、β-actin抗體及HRP標(biāo)記的抗鼠二抗均購于美國Abcam公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中,用0.25%的胰酶消化傳代培養(yǎng)。

        1.2.2 EGF處理A549細(xì)胞 將處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.25%胰酶消化后,按2×105個(gè)/mL的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中,分為4個(gè)組,分別為未處理組和EGF 10、25、50 ng/mL處理組,待作用24 h后檢測(cè)EGFR蛋白的表達(dá)水平。

        1.2.3 肺腺癌細(xì)胞EGFR siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞按2×105個(gè)/mL接種于6孔板中,待細(xì)胞鋪滿90%~95%孔底面積時(shí),更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。將100μL無血清OPTI培養(yǎng)液與7.5μL Lipofectamine?RNAiMAX Reagent加入無菌EP管中輕輕混勻,100 μL無血清OPTI培養(yǎng)液與原濃度為20μmol/L的EGFR特異性siRNA 5μL在另一無菌EP管中輕輕混勻后,將2個(gè)管移入1個(gè)EP管中再輕輕混勻,靜置5 min,兩者混合制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,室溫靜置25 min形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液,加入對(duì)應(yīng)孔板中(在這一過程中動(dòng)作輕柔,切忌劇烈震蕩)。以空質(zhì)粒載體組作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h,實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、EGFR siRNA-1組、EGFR siRNA-2組和EGFR siRNA-3組,分別采用Realtime RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)EGFR mRNA和蛋白表達(dá)水平來評(píng)價(jià)3個(gè)siRNA的沉默效果。

        1.2.4 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光PCR

        Trizol法提取總RNA,具體步驟見Trizol總RNA抽提試劑盒說明書;逆轉(zhuǎn)錄SYBR Green及實(shí)時(shí)熒光PCR步驟見試劑說明書。GAPDH引物序列:上游5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′, 下 游 5′-CCTTC TCCATGGTGGTGAAGAC-3′;EGFR引物序列:上游5′-GTGACCGTTTGGGAGTTGAT-3′, 下 游 5′-GGGC GACTATCTGCGTCTAT-3′;GAPDH作為內(nèi)參。

        1.2.5 Western blot法檢測(cè) 利用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,用以檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá),蛋白濃度測(cè)定后,按每孔20μL上樣量用Loading Buffer配平,沸水加熱后上樣,行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳,轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。經(jīng)洗滌后,加入一抗(鼠抗人EGFR抗體1∶1 000稀釋,鼠抗人LC3抗體1∶2 000稀釋,β-actin抗體1∶5 000稀釋),37℃孵育1h后4℃過夜;PBST洗滌后加入二抗(HRP標(biāo)記的抗鼠二抗1∶5 000稀釋)。洗滌膜后,利用Easy See化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光,顯影。用Image Tool測(cè)量目的蛋白條帶盒內(nèi)參條帶的灰度值,以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

        1.2.6 沉默EGFR表達(dá)后檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá) A549細(xì)胞分為4組:EGFR siRNA組,空載體組,轉(zhuǎn)染試劑組(加入轉(zhuǎn)染試劑)和空白對(duì)照組。4組同時(shí)加入等量濃度為50 ng/mL EGF處理24 h后,收集細(xì)胞。Western blot方法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況。

        1.2.7 透射電子顯微鏡觀察自噬小體 A549細(xì)胞分為2組:EGFR siRNA組和空載體組。用配制好2.5%戊二醛固定液固定各組細(xì)胞,放入4℃冰箱保存,且無劇烈晃動(dòng),固定至少1 h后送電鏡室。用1/15 mol/L的磷酸緩沖液洗滌標(biāo)本3次,每次約15 min;用1%四氧鋨酸固定標(biāo)本1~2 h,4℃冰箱保存;用磷酸緩沖液再次洗滌標(biāo)本3次,每次約15 min;經(jīng)50%、70%、80%、90%的丙酮濃度梯度脫水,各1次,約15 min,100%丙酮浸入15 min,2次;包埋劑浸透3 h,室溫或過夜:100%丙酮與包埋液比例為1∶1,37℃、60 min;100%丙酮與包埋液比例為1∶3,37℃、過夜;純包埋液浸透37℃、5 h。用環(huán)氧樹脂把標(biāo)本包埋在包埋板或者膠囊中,然后依次置于37℃、24 h;60℃、48 h,進(jìn)行聚合;用超薄切片機(jī)靶標(biāo)被切成超薄切片,厚約50 nm,接著用醋酸雙氧鈾染色30~45 min,檸檬酸鉛染色5~30 min,透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體情況。

        1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用xˉ±s表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

        2 結(jié)果

        2.1 EGFR蛋白表達(dá)水平

        在肺腺癌A549細(xì)胞中加入不同濃度的EGF,用Western blot法檢測(cè)EGFR蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果見圖1,可見未處理組和10、25、50 ng/mL EGF處理組的EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.42±0.02和0.55±0.03、0.94±0.04、4.34±0.16,顯示EGFR蛋白的表達(dá)水平隨EGF濃度的增加而升高。

        圖1 不同濃度EGF處理肺腺癌A549細(xì)胞后EGFR蛋白表達(dá)

        2.2 特異性EGFR siRNA對(duì)EGFR蛋白表達(dá)的沉默效應(yīng)

        Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖2,陰性對(duì)照組以及轉(zhuǎn)染EGFR siRNA-1、EGFR siRNA-2、EGFR siRNA-3后,肺腺癌A549細(xì)胞EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.67±0.02、0.30±0.02、0.63±0.07、0.56±0.03。用Real-time RT-PCR法檢測(cè)陰性對(duì)照組與EGFR siRNA-1組細(xì)胞的EGFR mRNA表達(dá)水平,結(jié)果見圖3,顯示分別為1.06±0.24、0.10±0.01,表明siRNA-1可明顯降低EGFR表達(dá)(P均<0.05),因此采用EGFR siRNA-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        圖2 Western b lot方法檢測(cè)siRNA對(duì)A549細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)的沉默效果

        圖3 Real-time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染EGFR siRNA-1后A549細(xì)胞EGFR m RNA的表達(dá)

        2.3 EGFR siRNA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的自噬效應(yīng)分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

        Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染EGFR siRNA后A549細(xì)胞自噬效應(yīng)分子LC3蛋白表達(dá)情況,結(jié)果見圖4,顯示轉(zhuǎn)染EGFR siRNA組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比例高于其他3組(P<0.05);空載體組,轉(zhuǎn)染試劑組(加入轉(zhuǎn)染試劑)和空白對(duì)照組細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比例無明顯差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)表明抑制EGFR表達(dá)可以提高肺腺癌A549細(xì)胞自噬活性。

        圖4 Westernblot方法檢測(cè)不同處理組A549細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)

        2.4 A549細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染EGFRsiRNA后自噬小體的變化情況

        電鏡觀察結(jié)果見圖5,在電鏡視野下,自噬小體為雙層或多層膜的球狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含胞漿成分,如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。可見相比空載體組,EGFR siRNA組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量顯著增多。可見沉默EGFR基因后,經(jīng)電鏡直觀顯示A549細(xì)胞自噬活性升高。

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)研究表明,首先,應(yīng)用特異性EGFR siRNA可以在RNA水平和蛋白水平有效降低表皮生長因子受體EGFR的表達(dá)量,成功實(shí)現(xiàn)EGFR基因轉(zhuǎn)錄后沉默效應(yīng)。其次,在加入表皮生長因子EGF條件下,通過特異性EGFRsiRNA干擾技術(shù)降低EGFR表達(dá),實(shí)驗(yàn)通過抑制EGFR表達(dá)可以提高肺腺癌A549細(xì)胞自噬活性,會(huì)誘導(dǎo)自噬活性的增加。WEI[10]等通過EGF刺激及血清饑餓處理兩項(xiàng)條件下已有證實(shí)增強(qiáng)EGFR信號(hào)通路可以降低細(xì)胞自噬的活性。而我們通過應(yīng)用特異性siRNA干擾技術(shù),逆向證明降低EGFR表達(dá)量,可以誘導(dǎo)自噬增加。再次,我們通過透射電子顯微鏡更加直觀的觀察,在加入EGF處理下,EGFRsiRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后與對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量雙層杯狀膜包裹的細(xì)胞內(nèi)容物的自噬小體。

        圖5 透射電子顯微鏡顯示A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

        RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)是非常重要的生物學(xué)研究工具,并且在基因治療方面表現(xiàn)出巨大的潛力[11]。研究表明RNAi包括兩個(gè)關(guān)鍵的部分:siRNA的合成和iRNA與沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合來介導(dǎo)RISC地靶mRNA的切割,最終誘發(fā)放大沉默信號(hào),進(jìn)而關(guān)閉相關(guān)的蛋白表達(dá)[12-15]。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用特異性EGFRsiRNA可以在RNA水平和蛋白水平有效降低表皮生長因子受體EGFR的表達(dá)量,成功實(shí)現(xiàn)EGFR基因轉(zhuǎn)錄后沉默效應(yīng)。

        EGFR是一種廣泛分布于機(jī)體各組織細(xì)胞膜上的多功能跨膜糖蛋白,可與EGF結(jié)合形成二聚體發(fā)生交聯(lián)磷酸化,待激活細(xì)胞內(nèi)TK區(qū)后會(huì)激活以下信號(hào)通路傳導(dǎo):Ras/MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、STAT信號(hào)通路和Beclin1信號(hào)通路[16]。配體EGF對(duì)EGFR信號(hào)通路內(nèi)在化作用有明顯的影響。KUMA[17]等研究表明,在不同劑量EGF的誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致EGFR復(fù)合物內(nèi)在化的途徑和效果不同。因此在實(shí)驗(yàn)中選擇不同濃度梯度的EGF,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,結(jié)果顯示隨著EGF濃度升高,EGFR表達(dá)呈濃度依賴性升高。

        另一方面,細(xì)胞自噬是胞漿內(nèi)長壽蛋白和多余的細(xì)胞器通過自噬作用被包裹形成自噬小體,消化降解為氨基酸、脂肪酸等供細(xì)胞循環(huán)利用,重新合成大分子有機(jī)物和ATP,進(jìn)而維持細(xì)胞的正常代謝[18]。自噬相關(guān)蛋白LC3可分為三種亞型,其中LC3B亞型與自噬關(guān)系最為密切。通常我們對(duì)LC3的檢測(cè)即對(duì)LC3B的檢測(cè)。一般情況下,細(xì)胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯合成的LC3經(jīng)過加工,會(huì)形成LC3-Ⅰ;當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾,進(jìn)而與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,便形成LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上,則意味著自噬小體的最終形成,因此,LC3-Ⅱ的含量與自噬泡的數(shù)量(即自噬的活性)呈正比[19-20]。細(xì)胞自噬與許多疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系,尤其是自噬作用及自噬因子的調(diào)節(jié)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。細(xì)胞自噬與許多疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。自噬可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境的關(guān)系來促進(jìn)腫瘤的生長[21-22]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于低氧等壓力環(huán)境時(shí),缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxiainducible factor 1α,HIF-1α)和 BCL2/腺病毒EIB19kd結(jié)合蛋白(BCL-2/adenovirus EIB 19kdinteracting protein 3,BNIP3)被激活,阻止BCL-2和Beclin1的相互作用,從而激活自噬通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)于低氧的應(yīng)對(duì)能力[21-23]。另一方面,自噬對(duì)腫瘤也有抑制作用,自噬的異常可導(dǎo)致多種抑癌基因的失活和癌基因的激活,有研究顯示小鼠模型的胰腺細(xì)胞經(jīng)致癌物誘導(dǎo)后,所形成的癌前病灶及腺瘤的自噬能力增加,但當(dāng)癌細(xì)胞形成后自噬活性就會(huì)下降[24]。此外,在Braf誘發(fā)的肺癌模型以及Atg7沉默的腫瘤模型中會(huì)出現(xiàn)脂代謝受損,對(duì)于缺乏自噬活性的腫瘤細(xì)胞來說,會(huì)降低其處理調(diào)節(jié)營養(yǎng)缺失的能力[25]。由此可見,自噬不僅對(duì)細(xì)胞正常生理狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用,同時(shí)也對(duì)腫瘤細(xì)胞有雙重作用,并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的代謝有調(diào)節(jié)作用。

        綜上所述,在腫瘤細(xì)胞中,通過調(diào)節(jié)EGFR基因表達(dá),經(jīng)下游信號(hào)通路傳導(dǎo)后,最終對(duì)自噬活性有明顯的影響,但由于自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞作用較為復(fù)雜,需要更深入全面的研究,才能更能明確了解自噬與EGFR信號(hào)通路在肺腺癌病理生理機(jī)制,進(jìn)而為肺腺癌臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

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