李玉文，李 辰，封江彬，范 莉，劉建香，劉青杰，田 梅*

(中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088)

紫外(ultraviolet，UV)線電磁輻射，根據(jù)波長分為UVA(315～400 nm)、 UVB(280～315 nm)和 UVC(190～280 nm)，UV線能對(duì)人體健康產(chǎn)生不良效應(yīng)，可導(dǎo)致DNA損傷、炎癥、免疫抑制、光老化、基因突變和皮膚癌。目前，世界癌癥研究協(xié)會(huì)已將紫外線(UVA和UVB)列為1類致癌源[1]。UVB對(duì)皮膚的損傷作用最強(qiáng)，研究表明，過量的UVB照射是皮膚癌的主要危險(xiǎn)因素[2]。

角質(zhì)形成細(xì)胞是人體抵御紫外線輻射的第一道防線，不僅是機(jī)體的保護(hù)細(xì)胞，而且參與各種細(xì)胞生物學(xué)過程，如免疫、炎癥、增生以及腫瘤轉(zhuǎn)化等[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)紫外線照射可誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生大量的 轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)[6-7]。TGF-β可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等過程，與皮膚炎癥和皮膚癌的進(jìn)展密切相關(guān)[9]。因此，研究TGF-β在UVB誘導(dǎo)的皮膚損傷、炎癥及皮膚癌中的作用機(jī)制，可以為預(yù)防與治療紫外誘發(fā)皮膚腫瘤尋找新的生物靶點(diǎn)。

miRNA芯片研究發(fā)現(xiàn)，紫外線誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞某些miRNA的表達(dá)變化可能與輻射后TGF-β1通路的表達(dá)和調(diào)控有關(guān)，可能在UV引起的致癌過程中發(fā)揮作用[9]，TGF-β1是調(diào)控UV輻射誘導(dǎo)miRNA表達(dá)的重要的節(jié)點(diǎn)分子之一，這些miRNA包括let-7c，miR-23a、b，miR-139-6p等，其中miR-23a的表達(dá)與腫瘤生長、侵襲及血管生成有關(guān)。let-7c是let-7基因家族中的一員，在細(xì)胞生長、增殖等方面具有重要作用，與關(guān)鍵的原癌基因直接相關(guān)。

環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎氐南匏倜福c炎癥、癌癥和其他許多病理過程密切相關(guān)。高劑量紫外線照射能夠誘導(dǎo)皮膚中COX-2的上調(diào)表達(dá)，在UVB長期照射以及UVB所引發(fā)的鱗狀細(xì)胞癌中COX-2的表達(dá)也顯著增高[10-11]，在皮膚癌的發(fā)生中起重要作用。

本研究利用UVB照射TGF-β1處理的人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)，檢測(cè)細(xì)胞中敏感的與多種人惡性腫瘤密切相關(guān)的miRNA-23a和let-7c兩種miRNA及炎癥反應(yīng)蛋白COX-2通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討TGF-β1與紫外輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清購自Gibco公司；MEM培養(yǎng)基購自康寧公司；TGF-β1購自CST公司；Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA引物和探針以及TaqMan Gene Expression Master Mix實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自Applied Biosystems公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自Thermo公司；β-actin、COX-2、caspase-3抗體均購自CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔和抗鼠二抗購自中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞照射

HaCaT細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫，將細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

紫外照射是利用Ultra-Violet Products公司的CL-1000系統(tǒng)，UVB波長為302 nm，輻照度為55.5 W/m2，照射距離約為15 cm，照射劑量依據(jù)本所輻射防護(hù)研究室TN-2340紫外線強(qiáng)度劑量校準(zhǔn)。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入儀器內(nèi)，照射一定時(shí)間后取出。研究量效關(guān)系時(shí)選取10、20、30 mJ/cm2的UVB；研究時(shí)效關(guān)系時(shí)選擇30 mJ/cm2的UVB。

1.3 細(xì)胞分組

對(duì)照組細(xì)胞采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；處理組細(xì)胞是將 3 μL 的 TGF-β1(濃度為 10 ng/μL)加入到 3 mL HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)基中，TGF-β1的終濃度為10 ng/mL，作用48 h后再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的實(shí)驗(yàn)。

研究轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)時(shí)，采用10、20、30 mJ/cm2的UVB分別照射對(duì)照組和處理組細(xì)胞，于照后6 h檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR-23a和let-7c的表達(dá)變化；采用30 m J/cm2的UVB分別照射對(duì)照組和處理組細(xì)胞，于照后4、12和24 h檢測(cè)照后不同時(shí)間對(duì)兩組細(xì)胞中miR-23a和let-7c表達(dá)變化的影響。

研究翻譯水平的表達(dá)時(shí)，利用30 mJ/cm2的UVB分別照射對(duì)照組和處理組細(xì)胞，于照后不同時(shí)間(0、2、4、8、12、24和48 h)檢測(cè)兩組細(xì)胞中COX-2和凋亡執(zhí)行分子caspase-3蛋白表達(dá)的變化。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)m iR-23a和let-7c表達(dá)水平

使用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞RNA。利用TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)總體積為7.5μL，其中RNA樣本量為2.5μL(12.5 ng/μL)，反應(yīng)條件為16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min。利用TaqMan Gene Expression Master Mix實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為12μL，其中反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為0.9μL，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，45個(gè)循環(huán)。HaCaT細(xì)胞的miRNA-23a和let-7c表達(dá)水平以U6為內(nèi)參，利用Applied Biosystems 7500 Sequence Detection Software軟件，依據(jù)相對(duì)定量的2-ΔCT法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 Western blot檢測(cè)COX-2和caspase-3蛋白表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解提取總蛋白，并采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制12%的分離膠和4%積層膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳(恒壓100 V)，蛋白上樣量為30μg，后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜(恒壓100 V，1.5 h)，加入5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，依據(jù)說明書分別加入COX-2和caspase-3的一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min；再分別加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)，室溫孵育60 min，TBST洗滌3次，每次20 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，顯影并成像。利用Image J軟件對(duì)COX-2蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的f檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對(duì)照后m iR-23a和let-7c表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-23a的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)10和30 m J/cm2的UVB照射后6 h，miR-23a的表達(dá)未見明顯變化；20 m J/cm2的UVB照射后6 h，miR-23a的表達(dá)略有升高。30 mJ/cm2的UVB照射后12 h和24 h，對(duì)照組miR-23a的表達(dá)增強(qiáng)(P均＜0.05)。結(jié)果表明當(dāng)一定能量的UVB照射一段時(shí)間后可以誘導(dǎo)正常HaCaT細(xì)胞中miR-23a的表達(dá)上調(diào)。

處理組細(xì)胞經(jīng)10、20、30 m J/cm2的UVB照射后6 h，miR-23a的表達(dá)均升高(P均＜0.05)，且與同一照射劑量的對(duì)照組相比，處理組miR-23a的表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P均＜0.05)；30 m J/cm2的UVB照射后不同時(shí)點(diǎn)，處理組miR-23a的表達(dá)均增強(qiáng)(P均＜0.05)，在照后12 h時(shí)表達(dá)上調(diào)最顯著；且與同一時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組相比，處理組miR-23a的表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P均＜0.05)，說明TGF-β1可促進(jìn)受照細(xì)胞中miR-23a的表達(dá)水平。然而，未受照的處理組細(xì)胞中miR-23a的表達(dá)無明顯變化，說明TGF-β1作用于HaCaT細(xì)胞48 h，不能誘導(dǎo)未受照細(xì)胞中miR-23a的表達(dá)上調(diào)。此外，結(jié)合A、B兩圖可以看出，對(duì)照組細(xì)胞在30 mJ/cm2的UVB照射后6 h，未見miR-23a的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而處理組細(xì)胞在30 m J/cm2的UVB照射后0 h即出現(xiàn)顯著的miR-23a表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步說明TGF-β1可對(duì)受照HaCaT細(xì)胞中miR-23a的表達(dá)起到促進(jìn)作用。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)m i-23a的表達(dá)變化情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞let-7c的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示，20和30 m J/cm2的UVB照射后6 h，對(duì)照組細(xì)胞中l(wèi)et-7c的表達(dá)顯著升高(P均＜0.05)，且30 m J/cm2的UVB照射后不同時(shí)點(diǎn)，對(duì)照組let-7c的表達(dá)均明顯上升(P均＜0.05)，可以看出，UVB照射可促進(jìn)正常HaCaT細(xì)胞中l(wèi)et-7c的表達(dá)。

與同一受照劑量的對(duì)照組相比，處理組未受照細(xì)胞與受10 mJ/cm2UVB照射的細(xì)胞內(nèi)let-7c表達(dá)明顯升高(P均＜0.05)，而20和30 m J/cm2UVB照射后，處理組let-7c表達(dá)明顯下調(diào)(P均＜0.05)。30 mJ/cm2的UVB照射后4、12和24 h，處理組細(xì)胞let-7c的表達(dá)與同一時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組相比，均有所降低(P均＜0.05)，提示TGF-β1可在一定范圍內(nèi)抑制受照HaCaT細(xì)胞的let-7c表達(dá)。

2.2 TGF-β1對(duì)照后COX-2和Caspase-3表達(dá)的影響

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)let-7c的表達(dá)變化情況

Western blot檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中COX-2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示，未受照和照射后0 h的對(duì)照組細(xì)胞中COX-2不表達(dá)，自照射后2 h開始，對(duì)照組細(xì)胞中出現(xiàn)COX-2的蛋白表達(dá)，說明UVB照射一段時(shí)間后可以誘導(dǎo)正常HaCaT細(xì)胞中COX-2的表達(dá)；而處理組細(xì)胞在UVB照射前后，COX-2蛋白均表達(dá)，尤其是照射后12、24和48 h，COX-2的表達(dá)較照射后0 h組明顯增強(qiáng)(P均＜0.05)，照后同一時(shí)點(diǎn)內(nèi)，處理組較對(duì)照組COX-2表達(dá)均顯著上調(diào)(P均＜0.05)，提示TGF-β1和UVB均可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中COX-2的表達(dá)，而TGF-β1預(yù)先作用于細(xì)胞后，可使受照細(xì)胞中COX-2的表達(dá)水平上調(diào)更為明顯。

圖3 30 m J/cm2 UVB照射后不同時(shí)間COX-2蛋白的表達(dá)變化

Western blot檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中caspase-3的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示：對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)UVB照射后2、12、24和48 h，活化的caspase-3亞基表達(dá)顯著增加，特別是照射后12 h開始caspase-3的活化明顯增強(qiáng)，并一直持續(xù)至48 h；而處理組細(xì)胞受照后，活化的caspase-3亞基在照射后12 h時(shí)增加明顯，而后隨時(shí)間延長而明顯減少，提示TGF-β1預(yù)先作用于HaCaT細(xì)胞，可抑制caspase-3亞基的活化。

圖4 30 m J/cm2 UVB照射后不同時(shí)間caspase-3蛋白的表達(dá)變化

3 討論

紫外線可致癌，其中UVB致癌性最強(qiáng)，曬紅及曬傷作用為UVA的1 000倍。由于紫外線照射不能穿透人體皮膚，因此表皮層是紫外線誘導(dǎo)的損傷和致癌的主要部位[9]。正常情況下，受損細(xì)胞可通過自身修復(fù)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來應(yīng)對(duì)損傷，若受損細(xì)胞未能及時(shí)修復(fù)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的形成[12]。

有研究報(bào)導(dǎo)紫外線照射可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生大量的TGF-β[6]。眾所周知，TGF-β在調(diào)節(jié)多種生物學(xué)事件中表現(xiàn)出雙重作用，如細(xì)胞增殖和分化、血管生成、炎癥和免疫應(yīng)答以及癌癥。在皮膚癌早期，TGF-β是角質(zhì)形成細(xì)胞的有效生長抑制劑，對(duì)腫瘤起抑制作用；而到晚期，TGF-β失去對(duì)癌細(xì)胞生長抑制，且TGF-β誘導(dǎo)的皮膚炎癥有利于皮膚癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[13]。TGF-β的細(xì)胞和分子功能的復(fù)雜性使得其在組織穩(wěn)態(tài)、疾病發(fā)展和腫瘤發(fā)生中的作用變得復(fù)雜。

本研究在前期建立紫外輻射模型的基礎(chǔ)上，利用TGF-β1預(yù)先對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)UVB照射后輻射敏感的腫瘤相關(guān)miRNA-23a、let-7c的表達(dá)水平，分析炎癥相關(guān)蛋白COX-2、凋亡執(zhí)行分子caspase-3的表達(dá)變化，探討TGF-β1在UVB誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞輻射損傷中的作用及機(jī)制。

miRNA是一類廣泛參與細(xì)胞重要生命過程的小分子RNA，已被公認(rèn)為是參與人類腫瘤發(fā)生的一類新基因[14]，在皮膚癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[15]。Kraemer[9]等利用miRNA芯片和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1是調(diào)控UV輻射誘導(dǎo)miRNA表達(dá)的重要的節(jié)點(diǎn)分子之一，這些miRNA包括let-7c，miR-23a、b，miR-139-6p等，其中miR-23a的表達(dá)與腫瘤生長、侵襲及血管生成有關(guān)，可調(diào)節(jié)UV誘導(dǎo)的光化學(xué)產(chǎn)物環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)的清除、抗凋亡和端粒酶1/Caspase-7/STK4表達(dá)[16]。在對(duì)HaCaT細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-23a是一種光保護(hù)性miRNA，過表達(dá)的miR-23a可以通過抑制幾個(gè)下游靶標(biāo)來減輕UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞損傷[16]。let-7c是let-7基因家族中的一員，在細(xì)胞生長、增殖等方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，let-7能直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)鍵的原癌基因，阻斷細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有抑癌基因樣作用[17]。此外，研究證實(shí)，let-7可通過調(diào)控高遷移率族蛋白A2(HMGA2)而抑制多種腫瘤的EMT過程[18-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可誘導(dǎo)經(jīng)UVB照射的HaCaT細(xì)胞中miR-23a的表達(dá)上調(diào)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[16]。對(duì)于let-7c蛋白，則表現(xiàn)為在未受照細(xì)胞及較低劑量UVB照射細(xì)胞中l(wèi)et-7c表達(dá)增加，而在較高劑量UVB照射細(xì)胞中，let-7c的表達(dá)明顯受到抑制，提示TGF-β1可能通過調(diào)節(jié)miR-23a和let-7c的表達(dá)進(jìn)而影響HaCaT細(xì)胞損傷的修復(fù)、CPD清除、抗凋亡甚至腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生等，但這種作用與受照劑量有關(guān)，TGF-β1對(duì)較高劑量UVB照射產(chǎn)生的損傷可能會(huì)有不同的作用和機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。

環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素(prostaglandins，PG)在合成過程中的重要限速酶。目前發(fā)現(xiàn)的亞型有3種：COX-1、COX-2和COX-3。COX-2是可在細(xì)胞因子、激素、致癌物質(zhì)、生長因子、紫外線等多種誘導(dǎo)因子的刺激下快速表達(dá)的誘導(dǎo)型酶，正常細(xì)胞中不表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2不僅廣泛參與機(jī)體炎癥等多種病理生理過程，而且參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。COX-2在UV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[21]，炎癥過程通過釋放各種炎性因子促進(jìn)表皮過度增殖和增生，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚癌[10]。研究證實(shí)非甾體抗炎藥和選擇性COX-2的抑制劑可以降低皮膚癌的發(fā)生[22]，目前COX-2已成為腫瘤預(yù)防與治療的新的生物靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1預(yù)先作用于HaCaT細(xì)胞后，COX-2的表達(dá)水平明顯增加，而對(duì)凋亡執(zhí)行分子caspase-3的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)UVB照射后不同時(shí)點(diǎn)，活化的caspase-3亞基表達(dá)均顯著增加，特別是照射后12 h開始，表達(dá)增強(qiáng)更為明顯，與我們前期觀察到的凋亡結(jié)果相符[23]；而處理組細(xì)胞受照后，活化的caspase-3亞基自照后24 h開始明顯減少，可能與TGF-β1誘導(dǎo)COX-2表達(dá)增加有關(guān)，有研究表明COX-2蛋白的過度表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞過度增殖，抑制caspase-3的表達(dá)[24]，從而使細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡失調(diào)，促進(jìn)腫瘤惡性行為的發(fā)生。

通過本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以調(diào)控多個(gè)基因/蛋白的表達(dá)，作為UVB輻射誘導(dǎo)miRNA表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其調(diào)節(jié)的miR-23a在一定UVB照射劑量范圍內(nèi)的高表達(dá)一方面可通過清除CPD保護(hù)受照細(xì)胞，增強(qiáng)HaCaT的細(xì)胞抗性；另一方面又因其抗凋亡作用而不利于細(xì)胞的損傷修復(fù)。TGF-β對(duì)let-7c的作用則可能導(dǎo)致let-7c的抑癌基因樣作用減弱，有發(fā)生皮膚腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。TGF-β誘導(dǎo)COX-2在UVB輻射后的高表達(dá)可以增加受照皮膚的炎癥反應(yīng)和損傷細(xì)胞的抗凋亡作用，Allen Guanqun Li等甚至認(rèn)為在皮膚癌發(fā)生的早期階段，TGF-β1誘導(dǎo)的皮膚炎癥可能超越了TGF-β1腫瘤抑制作用[13]。

TGF-β1對(duì)于UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞輻射損傷的作用機(jī)制非常復(fù)雜，明確TGF-β調(diào)控的生物因子的作用及與其他信號(hào)通路之間的關(guān)系對(duì)于UVB誘導(dǎo)的皮膚疾病的預(yù)防與治療十分重要。本研究針對(duì)的是在一定劑量范圍UVB的單次短時(shí)照射及TGF-β1的影響，以后還需進(jìn)一步模擬人體長期紫外暴露深入探討紫外輻射損傷及致癌作用。