鄔旭龍，肖 璐，林 華，楊澤曉，姚學(xué)萍，王 印*，張鵬飛，姜睿姣

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川成都611134；3.四川省畜牧科學(xué)研究院四川成都610066；4.成都海關(guān)，四川成都6l004l)

豬偽狂犬病毒(PRV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬瘟病毒(CFSV)、非洲豬瘟病毒(ASFV)、豬圓環(huán)病毒2 型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及豬細(xì)小病毒(PPV)是豬呼吸與繁殖系統(tǒng)常見病原，且CSFV、PCV-2、PRRSV、PRV、PPV 能夠引起免疫抑制，引起繼發(fā)感染，加重病情、造成死亡，給豬場造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。其中ASFV 于2018 年8月首次被報道傳入我國，已蔓延超過20 省，其傳染性強、致死率高，威脅巨大[4-5]。

QIAxcel 毛細(xì)管凝膠電泳(QIAxcel CGE Capillary gel electrophoresis，QIAxcel CGE)分析系統(tǒng)，是新一代的核酸片段分析系統(tǒng)[6]。在高壓電場驅(qū)動下，各組分的分子大小、帶電荷數(shù)、等電點等性質(zhì)不同，從而形成不同遷移速率，各組分依次移動至毛細(xì)管輸出端附近的光檢測器[7]，檢測和記錄其吸光度，并將各組分以吸收峰的形式動態(tài)直觀地記錄下來，自動分析出各目的片段的堿基數(shù)，該技術(shù)的出現(xiàn)極大地簡化了PCR 產(chǎn)物的分析步驟[8]、提高了檢測效率，且分辨率可達(dá)3 bp～5 bp，優(yōu)勢突出。

本研究以多重PCR 為基礎(chǔ)，并結(jié)合毛細(xì)管電泳建立了上述7 種病毒的新型檢測平臺，有效降低檢測成本，提高檢測效率，對毛細(xì)管凝膠技術(shù)在國內(nèi)的發(fā)展，尤其是在動物疾病診斷中的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 PRV (Bartha-K61 株、HB-98株活疫苗)、JEV(SA14-14-2 株活疫苗、HW1 株滅活疫苗)、CSFV(細(xì)胞源活疫苗)、PCV-2 (CP08 株、WH 株、ZJ/C 株滅活疫苗)、PRRSV (R98 株、JXA1-R 株滅活苗)、PPV (CP-99 株、WH-1 滅活苗)、豬O 型口蹄疫病毒(FMDV-O，O/GX/09-7 株+O/XJ/10-11 株)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV，華毒株）、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV，CV777 株)的核酸由本研究室提取自各疫苗。ASFV p72 質(zhì)粒由InvitrogenTM合成。副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫實驗室分離保存。65 份經(jīng)國標(biāo)或行標(biāo)檢測為PRV、CSFV、JEV、PCV、PRRSV 或PPV 一種或多種病毒核酸陽性的臨床樣本均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動檢實驗室保存、提供，樣本包括脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟、肝臟、流產(chǎn)胎等。

1.3 引物設(shè)計 從NCBI GenBank 中下載數(shù)株各病毒全基因序列，經(jīng)DNAMAN、DNAStar 等軟件分析，選取各病毒保守基因利用Oligo 7、Primer 5 等軟件設(shè)計7 對特異性引物。選取非同源性序列，設(shè)計1 對通用引物并在各特異性引物的5' 端添加通用引物序列(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.4 各病原重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 參考TIAN amp Virus DNA/RNA Kit 說明書，分別提取PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 基因組核酸，并將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以DNA 或cDNA 為模板，分別進(jìn)行單一PCR 擴增，反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，34 個循環(huán)；72 ℃3 min。將各PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化后分別克隆于pMD19-T 載體中，各陽性重組質(zhì)粒由InvitrogenTM公司測序。

1.5 多重PCR 體系的建立和優(yōu)化

1.5.1 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 多重PCR 采用25 μL反應(yīng)體系，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，混合特異性引物3.5 μL，上下游通用引物各1 μL，模板3 μL，ddH2O 補足25 μL。反應(yīng)程序：第一階段：94 ℃3 min；第二階段：富集和加標(biāo)簽階段，94 ℃30 s，退火30 s，72 ℃1 min，10 個循環(huán)；第三階段：指數(shù)擴增，94 ℃30 s，退火45 s，72 ℃1 min，34 個循環(huán)；第四階段：72 ℃總延伸3 min。

1.5.2 退火溫度及引物濃度的優(yōu)化 在25 μL 反應(yīng)體系優(yōu)化中，控制變量單一，首先對靶序列富集階段退火溫度進(jìn)行優(yōu)化(50 ℃～60 ℃)，再保持其它條件一致，利用最優(yōu)的靶序列富集階段退火溫度，對指數(shù)擴增階段的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化(50 ℃～60 ℃)，每個退火溫度梯度均設(shè)2 平行孔。采用最優(yōu)的退火溫度，預(yù)混14 條特異性引物使其體系濃度分別為：0.028 μmol/L、0.056 μmol/L、0.084 μmol/L、0.112 μmol/L、0.140 μmol/L、0.168 μmol/L、0.196 μmol/L、0.224 μmol/L、0.252 μmol/L、0.280 μmol/L，對特異性引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，采用已確定最優(yōu)的退火溫度及特異性引物濃度，對通用引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，使其體系終濃度分別為0.16 μmol/L、0.32 μmol/L、0.48 μmol/L、0.64 μmol/L、0.8 μmol/L、0.96 μmol/L、1.12 μmol/L、1.28 μmol/L、1.44 μmol/L、1.6 μmol/L，每孔均設(shè)2個復(fù)孔。根據(jù)不同條件下獲得的平行孔中各靶序列熒光信號取平均值(四舍五入后)進(jìn)行最優(yōu)條件篩選，建立能夠同時檢測PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 及ASFV 7 種豬病毒的多重PCR QIAxcel 毛細(xì)管凝膠電泳檢測平臺(PCR-QIAxcel)。

1.6 特異性試驗 采用TIAN amp Virus DNA/RNA Kit 提取FMDV-O、PEDV、TGEV 各商品疫苗核酸，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用TIAN amp Bacteria DNA Kit，提取HPS、APP、S.suis細(xì)菌基因組核酸，將7種特異性病原與FMDV-O、PEDV、TGEV、HPS、APP、S.suis菌毒株的基因組混合，采用優(yōu)化后的PCR-QIAxcel 進(jìn)行特異性驗證。判讀標(biāo)準(zhǔn)為157 bp～162 bp 可判斷為PRV，174 bp ～179 bp 可判斷為CSFV，208 bp～213 bp 可判斷為JEV，253 bp～258 bp可判斷為PCV-2，301 bp～306 bp 可判斷為PRRSV，351 bp～356 bp 可判斷為PPV，336 bp～341 bp 可判斷為ASFV。

1.7 靈敏度試驗 利用超微量分光光度計測定7 種病毒重組質(zhì)粒的濃度，并換算成拷貝數(shù)，對該7 種病毒的混合質(zhì)粒10 倍倍比稀釋，采用所建立PCR-QIAxcel 方法測定其最低檢測限。

1.8 重復(fù)性試驗 采用本實驗建立的PCR-QIAxcel方法，以濃度均為105拷貝/μL 經(jīng)混合的上述7 種重組質(zhì)粒模板作為模板，設(shè)置3 個平行組，收集每組中所有目的條帶對應(yīng)堿基數(shù)的數(shù)值，分析其變異系數(shù)(CV)，評價該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床應(yīng)用 采用所建立的方法，對臨床采集保存的65 份臨床樣本進(jìn)行PRV、 JEV、 CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 及ASFV 7 種病毒的檢測。同時參考國家推薦標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)中檢測方法(PRV：GB/T 18641-2002；JEV：GB/T 22333-2008；CSFV： GB/T 16551-2008； PCV-2： GB/T 21674-2008； PRRSV： GB/T 27517-2011； PPV： SN/T 1874-2007；ASFV：SN/T 1559-2010)，對65 份臨床樣品進(jìn)行檢測，并與PCR-QIAxcel 檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 各病原重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 對不同病原的核酸經(jīng)單一PCR 擴增顯示PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV 擴增的目的條帶分別為159 bp、177 bp、211 bp、254 bp、304 bp、353 bp，人工合成ASFV p72 質(zhì)粒PCR 擴增可見340 bp 的目的條帶(圖1)。將各PCR 膠回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化篩選出的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序，將結(jié)果與NCBI GenBank 中BLAST 比對顯示，重組質(zhì)粒中插入片段與各病原參考株的同源性均大于99%。表明PCR 擴增的基因片段均分別為各病毒的特異性片段，且各重組質(zhì)粒均正確構(gòu)建。

2.2 多重PCR 體系的建立和優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，該PCR-QIAxcel 方法的最佳反應(yīng)條件為：94 ℃3 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃60 s，10 個循環(huán)；94 ℃30 s，51 ℃45 s，72 ℃60 s，34 個循環(huán)；72 ℃總延伸3 min。最佳反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，混合特異性引物3.5 μL (終濃度為0.056 μmol/L)，混合通用引物2 μL (終濃度為0.64 μmol/L)，模板3 μL，ddH2O 補足25 μL。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR 鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmids by PCR

2.3 特異性試驗結(jié)果 采用建立的PCR-QIAxcel 進(jìn)行特異性試驗，結(jié)果顯示僅有7 種特異性病原出現(xiàn)擴增信號峰值，且條帶大小與預(yù)期相同，對照菌毒株均未見熒光信號峰(圖2)，表明該方法能很好的擴增并區(qū)分不同的目標(biāo)片段，具有較強的特異性。

圖2 PCR-QIAxcel 特異性試驗結(jié)果Fig.2 Cross-reactivity results of PCR-QIAxcel

2.4 靈敏度試驗結(jié)果 采用7 對特異性引物和一對通用引物，對PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 多重PCR 毛細(xì)管電泳檢測的靈敏度進(jìn)行測定，結(jié)果顯示PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測限分別為：4.56×103拷貝/μL、6.35×103拷貝/μL、1.98×103拷貝/μL、1.32×104拷貝/μL、3.21×103拷貝/μL、4.51×103拷貝/μL、3.37×103拷貝/μL。表明該多重檢測方法靈敏度較高，最低檢測限可達(dá)103拷貝/μL～104拷貝/μL，但比國標(biāo)或行標(biāo)里對應(yīng)病毒單一PCR 檢測方法的靈敏度略低。

2.5 重復(fù)性試驗 采用本研究建立的PCR-QIAxcel進(jìn)行重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，在3 次重復(fù)試驗中，QIAxcel 系統(tǒng)對7 種PCR 擴增產(chǎn)物的條帶大小判讀穩(wěn)定，各產(chǎn)物堿基數(shù)值的變異系數(shù)均小于1.0 %，表明該方法重復(fù)性較好。

圖3 靈敏度試驗結(jié)果Fig.3 Result of sensitivity test

表2 PCR 產(chǎn)物堿基數(shù)重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Repeatability results of base pair size of PCR products

2.6 臨床應(yīng)用 利用本研究建立的PCR-QIAxcel 對65 份臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，以國標(biāo)或行標(biāo)單一PCR 檢測方法為基準(zhǔn)，65 份臨床樣本中有53份檢出PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV中的一種或兩種病毒核酸陽性，ASFV 未檢出，該53 份陽性樣本中，僅檢出PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 中1 種病毒的樣本數(shù)量為35 份，檢出兩種病毒的樣本數(shù)量為16 份，檢出3 種病毒的樣本數(shù)量為2 份，兩種或兩種以上混合感染的樣本檢出率為34.0 % (18/53)?？傮w上看，PCR-QIAxcel 共檢出47 份陽性樣本，陽性樣本的檢出率為72.31 % (47/65)。在單一病原的檢測中，PCR-QIAxcel 與國標(biāo)、行標(biāo)的單一PCR 檢測方法的一致性為94.3 % (33/35)，而混合病原檢測二者的一致性為77.7 % (14/18)?？傮w而言，兩種方法的檢測符合率為88.68 %。該臨床樣本檢測結(jié)果表明，在單一感染的檢測中，PCR-QIAxcel 與國標(biāo)或行標(biāo)中規(guī)定的單一PCR 檢測方法相比，其一致性較高，但在多重感染的檢測中，其檢出率均低于單一PCR檢測方法(表3)。表明PCR-QIAxcel 在臨床樣品檢測中，尤其是混合感染樣品的檢測中，其檢測靈敏度不及單一PCR。

表3 臨床樣本檢測結(jié)果Table 3 Detection result of clinical samples

3 討 論

QIAxcel CGE 系統(tǒng)在核酸檢測中，尤其是對多重PCR 產(chǎn)物的檢測中QIAxcel CGE 優(yōu)勢突出：第一，分辨率高、最低可對片段大小僅間隔3 bp～5 bp的產(chǎn)物進(jìn)行辨別，且能夠根據(jù)遷移時間和峰面積直接讀出目的片段大??；第二，靈敏度高，核酸的最低檢測限可達(dá)0.1 ng/μL；其三，高效快捷、操作性強，成熟的配套商品化試劑極大地簡化了即用型預(yù)制卡夾的使用，省去了常規(guī)凝膠電泳配膠、制膠、上樣、拍照等繁瑣過程，12 個樣本的電泳檢測及分析僅需要約12 min；第四，安全環(huán)保，避免接觸核酸染料、紫外光、電泳緩沖等有機廢液，降低有毒有害物質(zhì)對人及環(huán)境的危害。

多重PCR 的核心在于多對引物的設(shè)計，為保證其擴增效率，各PCR 產(chǎn)物大小宜控制在100 bp～400 bp 之內(nèi)，這增加了引物設(shè)計的難度，導(dǎo)致PCR的“重數(shù)”越多、各目的條帶的大小越接近，從而使得普通的凝膠電泳越難以對各目的片段進(jìn)行很好地區(qū)分[9]。而將多重PCR 與QIAxcel CGE 聯(lián)用，便能很好地解決因目的條帶大小過于接近所導(dǎo)致的普通凝膠電泳難以分開的難題，且檢測時長也大大縮短，與常規(guī)凝膠電泳相比，電泳時間縮短三分之二，檢測效率大幅提高，QIAxcel CGE 在PCR 產(chǎn)物的快速篩查中發(fā)展?jié)摿薮?。本研究在靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)[10-11]，針對每一個靶序列，僅采用一對帶標(biāo)簽序列的特異性引物進(jìn)行靶序列富集，結(jié)合QIAxcel CGE 系統(tǒng)，建立了能夠同時檢測PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、ASFV、PPV 7 種豬病毒的多重檢測平臺。

多重PCR 體系中特異性引物濃度極低，在反應(yīng)的前10 個循環(huán)便被耗盡，使得第二擴增階段體系中僅由通用引物進(jìn)行擴增，減少了引物之間的非特異性結(jié)合，提升了擴增效率，提高靈敏度。本研究所建立的PCR-QIAxcel 對各病原質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測限為103拷貝/μL～104拷貝/μL，與其它常見的豬病毒或細(xì)菌性病源均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，多重PCR 擴增穩(wěn)定、重復(fù)性高，QIAxcel CGE 系統(tǒng)對目的條帶大小判讀結(jié)果的變異系數(shù)均小于1 %。該方法特異、靈敏、高效、穩(wěn)定、安全且簡潔，實現(xiàn)了多病毒在單管中同時檢測，在高通量檢測中意義深遠(yuǎn)，但在混合病原的檢測中，PCR-QIAxcel 檢出率低于單一PCR，究其原因主要在于多重檢測體系中引物多、擴增片段多，在擴增過程中，不同引物與引物之間、引物與其非靶片段之間、靶片段與靶片段之間難免會相互產(chǎn)生一定的干擾，而這些無法完全規(guī)避的干擾使得多重檢測的檢出率低于單一檢測。要提高多重檢測方法的靈敏度，可從以下幾方面進(jìn)行：第一，在采集組織樣品時，應(yīng)選取多種不同臟器并將其混合后提取核酸進(jìn)行檢測，以降低因不同病原在豬體內(nèi)各器官中分布和含量的差異而導(dǎo)致的靈敏度下降；第二，盡量采集新鮮的組織樣品并及時檢測，以求獲取更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果；第三，嚴(yán)格規(guī)范組織樣品核酸提取過程，以免不規(guī)范操作導(dǎo)致核酸降解而影響檢測結(jié)果。

本研究建立的多重檢測技術(shù)快速、簡便、自動化程度高，結(jié)果判讀直接、方便，無需以瓊脂糖作支持介質(zhì)，省去制膠、拍照等繁瑣過程，極大地簡化了分析步驟、提高檢測效率，并且安全，快捷，在高通量檢測體系中應(yīng)用潛能巨大。但QIAxcel CGE 系統(tǒng)也存在一些不足，例如對PCR 產(chǎn)物判讀存在3 bp～5 bp 的誤差，尤其是濃度較高的目的片段誤差最大可達(dá)8 bp～10 bp，這會對結(jié)果判定有一些影響，尤其是對堿基數(shù)相差較小的目的片段的判定，同時，這給PCR 擴增體系建立提出了新的挑戰(zhàn)，要求在保證檢測靈敏度的前提下，應(yīng)盡量調(diào)整各引物對濃度，使其擴增效率差異最低，以呈現(xiàn)最準(zhǔn)確的結(jié)果。