張笑笑 潘映紅 任富莉 蒲偉軍 王道平 李玉斌 陸 平 李桂英,* 朱 莉,*

基于多重表型分析的準(zhǔn)確評價高粱抗旱性方法的建立

張笑笑1,2潘映紅3任富莉2蒲偉軍2王道平3李玉斌2陸 平3李桂英3,*朱 莉2,*

1西南科技大學(xué), 四川綿陽 621000;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

干旱是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要非生物脅迫之一, 因此作物抗旱性研究具有重要理論和應(yīng)用價值。本研究對73份高粱材料萌發(fā)期和苗期的抗旱性進(jìn)行了初篩, 從中選擇15份抗旱材料和6份敏感材料, 通過室內(nèi)和田間試驗, 獲得干旱脅迫下幼苗的株高、葉長、葉寬等形態(tài)特征以及超氧化物歧化酶、丙二醛、過氧化物酶等生理生化指標(biāo)的響應(yīng)數(shù)據(jù), 并對高粱的抗旱性做進(jìn)一步的驗證, 最終確定抗旱型材料1份, 中等抗旱型材料1份, 干旱敏感型材料2份。本研究建立了一套基于多重表型分析的高粱抗旱性研究新方法, 即綜合運(yùn)用多種數(shù)據(jù)分析方法(包括隸屬函數(shù)法、主成分分析法、聚類分析法), 結(jié)合不同生長環(huán)境(田間試驗和室內(nèi)試驗)和不同生育期(萌發(fā)期和苗期)高粱響應(yīng)干旱脅迫的多種表型數(shù)據(jù)(形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)), 通過多重比較高粱抗旱性評價結(jié)果的一致性, 旨在系統(tǒng)、高效、準(zhǔn)確地判定高粱的抗旱性, 為高粱抗旱機(jī)制的研究和抗旱新品種的選育提供技術(shù)支撐。

多重表型分析; 高粱; 抗旱性; 萌發(fā)期; 苗期

隨著全球氣候變暖及水資源供需矛盾的加劇, 干旱已成為影響世界糧食生產(chǎn)最主要的非生物因素。高粱([L.] Moench)是世界上第五大禾谷類作物[1], 也是非洲等地的主要糧食來源。其適應(yīng)性較廣, 可作為高輻射、少降水的貧瘠地區(qū)種植的首選作物[2]。高粱具有較強(qiáng)的耐旱性, 但品種間的耐旱性存在很大差異, 因此耐旱品種的選育是提高干旱地區(qū)高粱產(chǎn)量的必要措施。

世界現(xiàn)存的高粱種質(zhì)超過38,000份, 但目前能夠成功應(yīng)用在高粱抗旱育種的數(shù)量非常有限, 僅占世界總量的3%[3], 究其原因在于大部分高粱種質(zhì)資源的抗旱性尚不明確, 缺乏一個高效、經(jīng)濟(jì)的耐旱性篩選方法。Reddy等[4]開發(fā)了幾種較為有效和可靠的篩選技術(shù), 如利用胚芽鞘和中胚軸長度、土壤高溫條件下的出苗率, 以及幼苗在短期干旱、中度干旱和極端干旱脅迫下的恢復(fù)能力等指標(biāo)鑒定高粱的抗旱性。此外, 還可以通過選擇干旱條件下基因型/突變體的精確表型(形態(tài)、生理和產(chǎn)量貢獻(xiàn)性狀), 制定有效的試驗室或田間篩選技術(shù)來評定干旱對作物的影響[5]。但是由于田間干旱試驗受環(huán)境影響較大, 重復(fù)性差, 因此僅僅通過田間試驗進(jìn)行作物的抗旱性篩選存在一定的難度和不準(zhǔn)確性。

由于作物生長周期較長, 建立和應(yīng)用萌發(fā)期及苗期的快速鑒定方法將有助于提高抗旱性研究效率。萌發(fā)期是作物生長的關(guān)鍵時期, 在室內(nèi)通過模擬干旱脅迫進(jìn)行萌發(fā)期的抗旱篩選, 具有環(huán)境穩(wěn)定、操作性強(qiáng), 也具有可對大批量的品種進(jìn)行初步篩選的優(yōu)點(diǎn), 因此被廣泛應(yīng)用于小麥[6]、玉米[7]、向日葵[8]、高粱[9]的抗旱性鑒定。然而某些品種在不同生長發(fā)育時期的抗性存在差異, 即萌發(fā)期抗旱的品種并不一定代表其中后期也抗旱[10]。而苗期干旱會嚴(yán)重影響植株的生長和生存能力[5], 并且苗期的抗旱篩選具有時間短、重復(fù)性強(qiáng)和簡單易行等優(yōu)點(diǎn)[11], 因此針對苗期的抗旱性評價也十分必要。

苗期抗旱性多采用干旱脅迫下的生理指標(biāo)進(jìn)行評價, Azarinasrabad等[12]認(rèn)為植物的生理特征可以作為是否受到水分脅迫的良好指標(biāo)。在干旱脅迫下, 植物產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS), 并與生物膜大分子反應(yīng)導(dǎo)致膜脂過氧化, 使丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量升高, 最終破壞生物膜的透過性, 同時引起類囊體膜損傷, 導(dǎo)致葉綠素含量下降, 光合作用降低[13]; 而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)則通過催化超氧陰離子自由基生成H2O2, 后者再由過氧化物酶(peroxidase,POD)脫毒[14], 從而加速ROS釋放與消耗[15], 進(jìn)而減輕干旱對植物的迫害。根據(jù)葉綠素含量、丙二醛含量、SOD及POD活性等生理生化指標(biāo)在干旱脅迫響應(yīng)中的變化趨勢來評價作物的抗旱性, 已在玉米[16]、水稻[17]、小麥[18]等作物中得到廣泛應(yīng)用, 然而也有研究發(fā)現(xiàn)抗旱性強(qiáng)的品種在PEG (polyethylene glycol)模擬干旱脅迫下某些生理指標(biāo)變化幅度較小, 某些生理指標(biāo)變化幅度較大, 說明僅憑生理指標(biāo)變化幅度并不能準(zhǔn)確真實反映作物的抗旱性[19]。

干旱脅迫不僅對植物的生理層面產(chǎn)生影響, 而且對植物的形態(tài)特征會產(chǎn)生不同程度的影響。已有研究表明, 干旱脅迫會導(dǎo)致萌發(fā)期種子的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和萌發(fā)抗旱指數(shù)等受到影響, 因而這些形態(tài)參數(shù)常被作為不同品種萌發(fā)期抗旱性鑒定的重要指標(biāo)。嚴(yán)重的干旱會抑制種子的萌發(fā), 而適宜的干旱可能會促進(jìn)種子的萌發(fā)[20]。而幼苗期, 隨干旱脅迫時間的延長, 株高、葉面積顯著降低, 根冠比顯著增大[21]。由此可知, 單從某一時期測定的指標(biāo)來判定品種的抗旱性存在一定的局限性, 應(yīng)結(jié)合多時期的形態(tài)和生理生化指標(biāo)對作物抗旱性進(jìn)行綜合評價。

當(dāng)前多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法已被廣泛應(yīng)用在作物抗旱性研究中。其中Mulima等[22]利用主成分分析法和聚類分析法對26份高粱材料的形態(tài)特征進(jìn)行基因型分組, 為抗旱育種提供抗性親本材料。埃塞俄比亞東北部Sirinka農(nóng)業(yè)研究中心利用主成分分析和聚類分析對雨養(yǎng)和灌溉2種試驗條件下的196份高粱種質(zhì)的14個形態(tài)性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 成功表征了這些品種的抗旱性[23]。汪燦等[24]采用隸屬函數(shù)法、主成分分析法、聚類分析等多項統(tǒng)計分析方法, 通過隸屬函數(shù)值、抗旱性度量值(值)、綜合抗旱系數(shù)和權(quán)抗旱系數(shù)對50份高粱的抗旱表型進(jìn)行系統(tǒng)評估, 并確定了與值密切相關(guān)的產(chǎn)量相關(guān)表型可作為高粱成株期抗旱性評價的指標(biāo)。各個分析方法均有各自的特點(diǎn), 其中隸屬函數(shù)法與主成分分析法雖然廣泛用于作物抗旱性分析, 但其結(jié)果是數(shù)值化的抗旱得分, 僅根據(jù)得分的微小差異就判定品種間抗旱性存在差異是不合理的, 在抗旱性評價方面仍有不足之處, 而聚類分析可以將抗旱性接近的歸為一類, 對抗旱性的鑒定結(jié)果起到了很好的分類作用, 因此綜合多種方法能夠較為準(zhǔn)確地評價作物的抗旱性。

本研究以73份高粱種質(zhì)資源或突變體為初始試驗材料, 通過PEG-6000對萌發(fā)期和苗期模擬干旱, 初步篩選抗旱和敏感品種, 并將這些高粱品種通過田間干旱試驗和室內(nèi)PEG模擬試驗, 獲取響應(yīng)干旱的株高、葉長、葉寬等形態(tài)以及MDA、SOD、POD等生理生化數(shù)據(jù), 進(jìn)而采用多種數(shù)據(jù)分析方法分別進(jìn)行抗旱性的評價, 最后綜合分析不同生長環(huán)境和不同方法對高粱抗旱性評價的差異, 建立一套新型的、準(zhǔn)確的高粱抗旱性分析方法(圖1), 同時篩選出抗旱性突出的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共73份, 包括33份高粱品種資源和40份甜高粱品種“九甜一”EMS誘變獲得的突變系, 編號依次為D01~D73, 分別由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所、生物技術(shù)研究所提供(表1)。

圖1 多重表型分析方法概要

表1 73份高粱材料信息

(續(xù)表1)

1.2 試驗方法

1.2.1 室內(nèi)萌發(fā)期和苗期抗旱初篩 采用PEG-6000模擬干旱進(jìn)行萌發(fā)期抗旱性鑒定[9-10], 設(shè)0 (CK)和15% PEG-6000兩個濃度。選每份高粱材料大小一致、飽滿、無病害的種子各40粒(每個處理20粒), 用2% NaClO消毒10 min, 蒸餾水清洗3遍后置對應(yīng)濃度溶液的培養(yǎng)皿中, 暗處理1 d, 之后進(jìn)行25℃、12 h/12 h光周期培養(yǎng), 每2 d更換一次溶液, 設(shè)3次重復(fù), 根據(jù)相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和萌發(fā)抗旱指數(shù)對高粱進(jìn)行抗旱性評價。

苗期試驗采用水培法。選取大小一致、飽滿的高粱種子消毒清洗, 置20 mL蒸餾水的培養(yǎng)皿里培養(yǎng)7 d, 其中暗處理1 d, 光周期培養(yǎng)6 d。之后挑取長勢一致的苗分別進(jìn)行對照和20% PEG脅迫處理(每個處理10株苗), 設(shè)3次重復(fù)。每2 d更換一次溶液, 于處理7 d時根據(jù)萎蔫指數(shù)判定高粱的抗旱性。

1.2.2 田間苗期抗旱性驗證 于2018年5月9日, 在廊坊基地旱棚播種21份高粱, 設(shè)2個區(qū)(對照組和干旱處理組), 每個區(qū)長8.44 m、寬3.29 m。行距40 cm、株距20 cm, 每行為1個品種(20株), 于五葉期進(jìn)行干旱處理(不澆水), 對照組正常澆水。干旱處理30 d時測定葉綠素含量、株高、葉長和葉寬, 并取嫩葉, 測定脯氨酸含量。每組處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 室內(nèi)苗期抗旱性復(fù)篩 選取高粱種子100粒, 消毒清洗, 置培養(yǎng)皿, 暗處理1 d, 25℃、光周期(12 h/12 h)培養(yǎng), 第5天轉(zhuǎn)移至1/4×Hogland營養(yǎng)液[25]里, 并于三葉期進(jìn)行20% PEG處理, 設(shè)3次生物重復(fù), 3次技術(shù)重復(fù), 處理24 h時, 測定株高, 并取葉片測定SOD、POD活性和MDA含量。

1.3 檢測指標(biāo)和方法

1.3.1 萌發(fā)期測定項目 自種子萌發(fā)之日起, 記錄種子第2、第4、第6、第8天發(fā)芽數(shù), 胚芽長度為種子直徑的1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn); 計算第4天的發(fā)芽勢和第10天的發(fā)芽率, 并計算相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和種子萌發(fā)抗旱指數(shù)。

發(fā)芽勢(GP, %) = 4 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100; 相對發(fā)芽勢(%) = (處理發(fā)芽勢/對照發(fā)芽勢)×100; 發(fā)芽率(GR, %) = 10 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100, 相對發(fā)芽率(%) = (處理發(fā)芽率/對照發(fā)芽率)×100; 種子萌發(fā)抗旱指數(shù)(DGRI) = 干旱種子萌發(fā)指數(shù)/對照種子萌發(fā)指數(shù), 萌發(fā)指數(shù)= 1.00nd2+0.75nd4+ 0.50nd6+ 0.25nd8, 其中, nd2、nd4、nd6、nd8分別為第2、4、6、8天的種子發(fā)芽率[9]。

1.3.2 苗期萎蔫指數(shù)等級判定 從20%PEG處理后的第7天開始調(diào)查幼苗表型變化, 并根據(jù)王蘭芬等[26]的方法進(jìn)行判定。

1.3.3 表型與生理生化指標(biāo)檢測 隨機(jī)選每份材料各3株, 測定株高、葉長、葉寬, 測定葉綠素含量(SPAD)、丙二醛含量、脯氨酸含量以及SOD和POD活性。采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量, 采用茚三酮法測定脯氨酸含量, 采用文獻(xiàn)[27]的方法測定SOD和POD活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 隸屬函數(shù)法的應(yīng)用 參照文獻(xiàn)[9]計算隸屬函數(shù)值, 當(dāng)某一指標(biāo)與抗旱性正相關(guān)時, 采用公式(1): ()=(-min)/(max-min); 反之, 采用公式(2): ()=1-(-min)/(max-min); 平均隸屬函數(shù)值采用公式(3):= (1/)∑。其中為第個材料第個性狀的隸屬值,為第個材料第個性狀處理與對照的比值;max、min分別為該性狀中最大和最小比值。

為將室內(nèi)初篩的苗期結(jié)果同萌發(fā)期結(jié)果進(jìn)行較好的比較, 對苗期萎蔫指數(shù)等級(WI)進(jìn)行賦值。將五級賦值1.00, 則一級賦值0.20, 二級賦值0.40, 三級賦值0.60, 四級賦值0.80, 等級越高, 對干旱越敏感,故采用1-萎蔫指數(shù)等級賦值評價不同高粱的抗旱性。其中萎蔫指數(shù)等級一級、二級和三級定為抗旱性較強(qiáng), 萎蔫指數(shù)四級定為抗旱中等, 萎蔫指數(shù)五級定為干旱敏感。利用HemI 1.0軟件繪制熱圖。

1.4.2 主成分分析法和聚類分析法的應(yīng)用 采用SPSS 22.0對獲得的表型數(shù)據(jù)的相對值(相對值=干旱處理均值/對照均值)進(jìn)行主成分分析和聚類分析。利用GraphPad Prism 5軟件繪制條形圖。

1.4.3 多重表型分析法的應(yīng)用 為消除量綱, 采取所測指標(biāo)數(shù)據(jù)的相對值進(jìn)行主成分分析和聚類分析(相對值= 處理值/對照值)。多重表型分析采取公式: 標(biāo)準(zhǔn)值= (-min)/(max-min)將主成分綜合得分和平均隸屬函數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化到區(qū)間[0, 1], 并計算兩者差異值= |-|, 其中為某材料的主成分綜合得分或者平均隸屬函數(shù)值,max、min分別為綜合得分/平均隸屬函數(shù)值中的最大和最小值,為某材料的平均隸屬函數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)值,為某材料的綜合得分的標(biāo)準(zhǔn)值。采取差異值0.5作為評判不同方法分析結(jié)果和同一方法在不同環(huán)境的分析結(jié)果之間差異的標(biāo)準(zhǔn)。利用GraphPad Prism 5軟件繪制柱狀圖和散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱萌發(fā)期和苗期抗旱性室內(nèi)鑒定

在15%PEG模擬干旱脅迫處理下, 高粱材料的萌發(fā)受到不同程度的影響?；陔`屬函數(shù)法對不同高粱材料種子的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和萌發(fā)抗旱指數(shù)的分析, 并根據(jù)平均隸屬函數(shù)值評價73份高粱材料的抗旱性, 平均隸屬函數(shù)值越大, 其抗旱性越強(qiáng)。其中D07和D38的平均隸屬函數(shù)值較大, 相對抗旱; D47及其后的高粱材料平均隸屬函數(shù)值均小于0.07, 相對干旱敏感(圖2)?；谖柚笖?shù)對苗期不同高粱材料在20%PEG干旱脅迫下的不同生長影響, 初步篩選出抗旱性較強(qiáng)的材料15份, 抗旱中等的材料24份, 干旱敏感的材料24份。

圖2 不同高粱材料萌發(fā)期的抗旱指標(biāo)隸屬函數(shù)值及苗期萎蔫指數(shù)等級

RGP: 相對發(fā)芽勢; RGR: 相對發(fā)芽率; DGRI: 萌發(fā)抗旱指數(shù); ASFV: 平均隸屬函數(shù)值; 1-WI: 1-苗期萎蔫指數(shù)等級賦值。

RGP: relative germination potential; RGR: relative germination rate; DGRI: germination drought resistance index; ASFV: average subordinative function value; 1-WI: 1-wilting index level assignment at seedling stage.

綜合初篩結(jié)果, 萌發(fā)期和苗期都抗旱的材料有5份, 其編號分別為D04、D14、D19、D22和D37, 排列于萌發(fā)期抗旱前17位; 萌發(fā)期和苗期都敏感的材料有6份, 其編號分別為D40、D41、D42、D49、D51和D53, 而苗期抗旱性表現(xiàn)較好的材料是D05、D10、D11、D16、D18、D24、D43、D60、D62和D65 (圖2)。為進(jìn)一步明確這21份材料的抗旱性, 進(jìn)行了旱棚驗證。

2.2 不同分析方法對21份高粱材料田間與室內(nèi)苗期抗旱性的評價

2.2.1 利用隸屬函數(shù)法分析不同高粱材料苗期抗旱性 田間試驗中D11和D16抗旱性較強(qiáng), D22、D53和D65對干旱比較敏感。室內(nèi)試驗中D11抗旱性最強(qiáng); D49和D53抗旱性差(表2)。

表2 21份高粱材料基于隸屬函數(shù)法的苗期抗旱性綜合評價

2.2.2 利用主成分法分析不同高粱材料苗期抗旱性

對田間試驗21份高粱材料的5項指標(biāo)(株高、葉長、葉寬、葉綠素含量和脯氨酸含量)進(jìn)行主成分分析, 根據(jù)特征根大于1的原則提取出3個主成分, 累積貢獻(xiàn)率為70.325%, 由特征向量得到各主成分的解析式1= 0.5141+ 0.0852+ 0.6133+ 0.27740.2225;2=-0.061+ 0.7572+ 0.2293-0.36140.3335;3=-0.3481+ 0.0142+ 0.2283-0.45540.7435;其中ZX~ZX分別代表株高、葉長、葉寬、葉綠素含量、脯氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)化值。綜合得分解析式以各主成分貢獻(xiàn)率為權(quán)數(shù)對主成分得分進(jìn)行加權(quán)平均, 即= 0.0631+ 0.2832+ 0.3703-0.15540.1995, 將各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值代入表達(dá)式即得到各高粱品種的抗旱綜合得分, 綜合得分越高, 抗旱性越強(qiáng)。其中D05的綜合得分最大, 抗旱性較強(qiáng), D40的綜合得分最小, 對干旱敏感(圖3-A)。

對室內(nèi)試驗21份高粱材料的4項指標(biāo)(株高、SOD、MDA、POD)進(jìn)行主成分分析, 提取特征根大于1的2個主成分, 累積貢獻(xiàn)率為77.574%, 綜合得分表達(dá)式為=-0.0251+ 0.3822-0.0253+ 0.4194, 其中1~4分別代表株高、SOD、MDA、POD的標(biāo)準(zhǔn)化值。將各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值代入表達(dá)式得到各高粱品種的抗旱綜合得分, 其中D11的綜合得分大于2, 抗旱性較強(qiáng)。D53的綜合得分小于-1, 對干旱敏感(圖3-B)。

2.2.3 利用聚類分析法分析不同高粱材料苗期抗旱性 采用離差平方和法對田間試驗21份高粱材料的5項指標(biāo)(株高、葉長、葉寬、葉綠素含量和脯氨酸含量)相對值數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析, 可以分為三大類(圖4-A)。第I類群包括D05、D11和D43高粱材料, 屬于抗旱型; 第II類群包括11份高粱材料D10、D49、D14、D42、D62、D51、D19、D65、D22、D04和D60, 屬于中等抗旱型; 第III類群包括7份高粱材料D16、D40、D18、D37、D41、D53和D24, 屬于干旱敏感型。

圖3 21份高粱材料基于主成分分析法的苗期抗旱性綜合評價

A: 21份高粱材料田間抗旱性綜合得分; B: 21份高粱材料室內(nèi)抗旱性綜合得分。

A: comprehensive scores of drought resistance of 21 sorghum accessions in field test; B: comprehensive scores of drought resistance of 21 sorghum accessions in laboratory test.

圖4 21份高粱材料基于聚類分析法的苗期抗旱性評價

A: 21份高粱材料田間抗旱性聚類分析結(jié)果; B: 21份高粱材料室內(nèi)抗旱性聚類分析結(jié)果。

A: clustering analysis results of drought resistance of 21 sorghum accessions in field test; B: clustering analysis results of drought resistance of 21 sorghum accessions in laboratory test.

根據(jù)室內(nèi)試驗21份高粱材料各單項指標(biāo)(株高、SOD、MDA、POD)的相對值數(shù)據(jù), 采用離差平方和法對21份高粱材料進(jìn)行聚類分析, 可以分為三大類(圖4-B)。第I類群包括D11號高粱材料, 屬于抗旱型; 第II類群包括9份高粱材料D42、D40、D14、D16、D18、D37、D05、D22和D65, 屬于中等抗旱型; 第III類群包括11份高粱材料D24、D04、D43、D62、D10、D41、D53、D49、D19、D51和D60, 屬于干旱敏感型。

2.3 基于多重表型分析法對高粱抗旱性的綜合評價

采用多重表型分析法, 通過不同生長環(huán)境(田間試驗和室內(nèi)試驗)和不同分析方法(隸屬函數(shù)法和主成分分析法)結(jié)果之間差異值的比較, 以獲得抗旱性一致的材料。若差異值大于0.5, 說明不同生長環(huán)境或不同分析方法比較的結(jié)果差異較大, 抗旱性不一致。

2.3.1 同一生長環(huán)境采用不同分析方法對高粱抗旱性評價的差異比較 采用多重表型分析法, 比較同一生長環(huán)境下不同分析方法對高粱抗旱性評價的差異。發(fā)現(xiàn)在田間試驗條件下和室內(nèi)試驗條件下21份高粱材料隸屬函數(shù)法和主成分分析法比較結(jié)果差異值都小于0.5 (圖5-A中的a和b), 說明采用隸屬函數(shù)和主成分分析法分析同一組數(shù)據(jù)差異較小。

綜合聚類分析的相似性原則和距離最近分類原則, 將隸屬函數(shù)法和主成分分析法的結(jié)果按聚類結(jié)果分為三類, 類內(nèi)高粱材料無順序差異(圖4)。田間試驗3種方法結(jié)果比較得到抗旱型材料D05, 中等抗旱型材料D10和D14, 干旱敏感型材料D53, 共計4份高粱材料; 室內(nèi)試驗3種方法結(jié)果比較得到抗旱型材料D11, 中等抗旱型材料D14、D16、D18、D22、D37、D40和D42, 干旱敏感型材料D04、D10、D24、D41、D43、D49、D51、D53和D60。

2.3.2 同一分析方法對不同生長環(huán)境生長的高粱抗旱性評價的差異比較 采用同一分析方法對田間和室內(nèi)試驗的高粱抗旱性評價結(jié)果進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn)有少數(shù)材料用同一種分析方法時, 差異值>0.5 (圖5-A中的c、d和e), 說明不同生長環(huán)境下采用同一方法分析有一定的差異, 即高粱的抗旱性隨生長環(huán)境的不同會表現(xiàn)出差異性。利用主成分分析法分析時, 以差異值0.5作為參考線, 差異較大的有6份材料(D05、D16、D19、D41、D43和D60); 利用隸屬函數(shù)法分析時, 以差異值1.0作為參考線, 差異較大的有5份材料(D05、D16、D41、D43和D49)(圖5-B)。另將田間隸屬函數(shù)法同室內(nèi)主成分分析法比較, 以差異值1.2和1.75作為參考線, 發(fā)現(xiàn)5份材料(D16、D19、D41、D43和D49)差異較大(圖5-B)。

3 討論

干旱是植物生長發(fā)育過程中的一個非常重要的非生物脅迫因子。干旱脅迫下植物的生長變化及響應(yīng)機(jī)理一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。植物在長期的進(jìn)化過程中形成適應(yīng)性的形態(tài)結(jié)構(gòu)[5,28]、生理響應(yīng)和生化過程[29]來降低干旱脅迫危害, 因此, 開展植物抗旱性研究對培育抗旱新品種、改良植物抗旱調(diào)控措施、促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

作物種質(zhì)資源的抗旱性研究對于育種工作有著非常重要的意義[30]。目前隸屬函數(shù)、主成分分析和聚類分析方法已經(jīng)在大豆[31]、小麥[32]、玉米[33]、花生[34]等作物抗旱性評價中廣泛應(yīng)用, 并且已有研究報道, 采用此3種方法對高粱萌發(fā)期進(jìn)行PEG脅迫已篩選到具有抗旱能力的高粱品種[9-10], 說明采用此3種方法對高粱抗旱性評價是可行的, 同時發(fā)現(xiàn)不同分析方法的結(jié)果存在一定的差異, 所以本研究在采用多種分析方法(隸屬函數(shù)法、主成分分析和聚類分析)基礎(chǔ)上, 建立了一種新型抗旱性評價方法。相對單一方法, 多重表型分析法綜合了各個方法的優(yōu)點(diǎn), 同時也避免了單一方法的弊端, 消除了單一指標(biāo)的片面性和多個指標(biāo)的信息重疊, 結(jié)果更合理可靠。

圖5 不同高粱抗旱性多重表型分析結(jié)果的差異度比較

A:不同分析方法和不同生長環(huán)境的多重表型分析結(jié)果的差異度比較; B:不同生長環(huán)境下高粱抗旱性多重表型分析結(jié)果的差異度比較。a: 田間試驗條件下隸屬函數(shù)法與主成分分析法分析結(jié)果之間的比較; b: 室內(nèi)試驗條件下隸屬函數(shù)法與主成分分析法結(jié)果之間比較; c: 田間與室內(nèi)試驗主成分分析法結(jié)果比較; d: 田間與室內(nèi)試驗隸屬函數(shù)法結(jié)果比較; e: 田間試驗隸屬函數(shù)法與室內(nèi)試驗主成分分析法結(jié)果之間比較。其中實線(0.5和1.0)作為c和d差異值的參考線, 用以評估不同生長環(huán)境同一分析方法多重表型分析結(jié)果的差異度; 虛線(1.20和1.75)和實線(1.5)作為e差異值的參考線, 用以評估田間試驗隸屬函數(shù)與室內(nèi)試驗主成分分析結(jié)果的差異度。

A: comparison of differences in multilevel phenotypic analysis results between by different methods and in different growth environments; B:comparison of differences in multilevel phenotypic analysis results of sorghum drought resistance under different growth environments. a: comparison between the results of the subordinate function method and the principal component analysis method under field test conditions; b: comparison between the results of the subordinate function method and the principal component analysis method under laboratory test conditions; c: comparison between the results of the principal component analysis in field and laboratory test; d: comparison the results of subordinate function methods between in field and in laboratory test; e: comparison the results between subordinate function method in field test and principal component analysis in laboratory test . The solid lines (0.5 and 1.0) were used as the reference lines for the difference values of c and d to evaluate the differences in the results of multilevel phenotypic analysis with the same analysis method in different growth environments; the dotted lines (1.20 and 1.75) and the solid line (1.5) are used as reference for the e difference value, which is used to assess the difference between the results of subordinate function in field test and the results of the principal component analysis in laboratory test.

經(jīng)過多重表型分析發(fā)現(xiàn)采用多種方法對高粱苗期抗旱性綜合評價具有一定的可靠性與差異性。該方法在綜合運(yùn)用3種分析方法的基礎(chǔ)上, 進(jìn)一步說明采用不同分析方法準(zhǔn)確評定同一生長環(huán)境下不同高粱材料抗旱性的可行性, 同時, 也發(fā)現(xiàn)了采用同一分析方法評價不同生長環(huán)境下高粱抗旱性存在差異性的問題。同一生長環(huán)境不同方法分析結(jié)果差異值均小于0.5, 證明了不同方法分析同一條件下的數(shù)據(jù)是可行的。另外通過同一分析方法(隸屬函數(shù)法)對不同生長環(huán)境生長的高粱抗旱性評價的差異比較,發(fā)現(xiàn)田間試驗和室內(nèi)試驗的抗旱性結(jié)果有一定的差異, 但總體上僅有極少數(shù)品種的田間實驗和室內(nèi)實驗結(jié)果差異較大, 并且發(fā)現(xiàn)差異較大的品種在多重表型分析后已被淘汰, 說明多重表型分析法可以對抗旱性做出較好的評估。同時發(fā)現(xiàn)圖5-A的e和d中各散點(diǎn)分布比較相似, 側(cè)面反映室內(nèi)不同方法比較結(jié)果相似, 具有較高的可信度。

綜合分析田間試驗3種方法后, 從21份高粱材料中確定4份抗旱性一致的材料, 而3種方法都是針對同一數(shù)據(jù)進(jìn)行的分析, 推測可能是由于主成分分析丟失信息所致, 因為主成分分析是從所有數(shù)據(jù)中提取了部分信息, 舍棄該方法結(jié)果, 將隸屬函數(shù)和聚類分析結(jié)果比較后得到抗旱型材料1份(D11), 中等抗旱型材料3份(D18、D37、D40), 干旱敏感型材料6份(D04、D10、D49、D51、D60、D65)共計10份高粱材料。將此結(jié)果和室內(nèi)3種方法分析結(jié)果比較, 最終得到抗旱型材料D11, 中等抗旱型材料D14, 干旱敏感型材料D53和D24。其中D11 (糯高粱)和D14 (千斤錘)對應(yīng)在室內(nèi)初篩時其苗期萎蔫指數(shù)等級屬三級, D53 (SEM-42-1)屬于五級, 結(jié)果吻合; 而D24 (河北糯雜5號)在室內(nèi)初篩苗期萎蔫指數(shù)屬于二級, 比較抗旱, 與多重表型分析的結(jié)果有差異, 可能是由于苗期萎蔫指數(shù)屬直觀觀察的數(shù)據(jù), 有一定的誤差, 但可以綜合幾項指標(biāo)共同判定抗旱性。

作物的抗旱性是由多個主效基因和微效基因控制的數(shù)量性狀, 受基因型和環(huán)境因素的共同影響[35], 有些作物整個生育期的抗旱性一致, 而有些作物整個生育期的抗旱性不一致[10]。本研究發(fā)現(xiàn), 部分材料萌發(fā)期抗性和苗期抗旱性存在差異。在此基礎(chǔ)上選擇萌發(fā)期和苗期抗性一致的材料及萌發(fā)期和苗期的抗性材料和敏感材料又分別進(jìn)行了田間和室內(nèi)的苗期干旱復(fù)篩, 通過形態(tài)特征和生理指標(biāo)相結(jié)合, 綜合運(yùn)用多種數(shù)據(jù)分析方法對各品種的抗旱性評價表明, 不同高粱材料在不同生長條件下、不同生育期其抗旱性有所不同, 因此通過建立多重表型分析方法獲得抗旱性明確、鑒定結(jié)果一致的材料是非常有必要的。本研究僅針對高粱萌發(fā)期和苗期的抗旱性評價, 而對于高粱全生育期的抗旱性評價, 依然需要通過田間對產(chǎn)量相關(guān)性狀的評估來進(jìn)一步做出科學(xué)、準(zhǔn)確的判定。另外, 由于基因遺傳指令轉(zhuǎn)化為性狀的方式仍不清楚, 所以表型數(shù)據(jù)將繼續(xù)成為重要生物學(xué)結(jié)果的有力預(yù)測指標(biāo)[36], 而隨著表型組學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 高通量的表型分析技術(shù)將廣泛應(yīng)用在作物響應(yīng)干旱脅迫的研究, 從而更快速、高效、準(zhǔn)確地鑒定作物的抗旱性。

4 結(jié)論

通過73份高粱材料室內(nèi)PEG干旱脅迫下萌發(fā)期相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和苗期萎蔫指數(shù)等相關(guān)表型鑒定及數(shù)據(jù)分析, 篩選出15份抗旱型材料和6份敏感型材料, 通過田間和室內(nèi)苗期的干旱脅迫獲取多種表型響應(yīng)數(shù)據(jù)(株高、葉長、葉寬等形態(tài)特征和MDA、SOD、POD等生理指標(biāo)), 并采用隸屬函數(shù)法、主成分分析法和聚類分析法綜合評估, 初步建立了一套較為系統(tǒng)、準(zhǔn)確評價高粱材料抗旱性的新方法, 同時鑒定到抗旱性突出的高粱材料, 為今后高粱抗旱品種選育、抗旱機(jī)理研究提供了技術(shù)支撐。

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Establishment of an accurate evaluation method for drought resistance based on multilevel phenotype analysis in sorghum

ZHANG Xiao-Xiao1,2, PAN Ying-Hong3, REN Fu-Li2, PU Wei-Jun2, WANG Dao-Ping3, LI Yu-Bin2, LU Ping3, LI Gui-Ying3,*, and ZHU Li2,*

1Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621000, Sichuan, China;2Institute of Biotechnology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Drought is one of the important abiotic stresses that restrict agricultural production. Research on drought resistance of crops is of significance in both theoretical and practical aspects. In this study, 73 sorghum accessions were preliminarily evaluated for drought resistance at the germination and seedling stages under simulated drought environment with PEG-6000. Among them, 21 accessions including 15 tolerant and 6 susceptible, were screened to measure the morphological characteristics such as plant height, leaf length and leaf width, and physiological and biochemical indicators such as superoxide dismutase (SOD) activity, malondialdehyde (MDA) content, and peroxidase (POD) activity. Finally, one accession was identified with high drought resistance, one accession was moderate drought resistance and two accessions with drought-sensitivity. A new evaluation method for sorghum drought resistance was established based on the multilevel phenotypic analysis, in which the data from subordinate function method, principal component analysis and clustering analysis were comprehensively applied, and combined with various phenotypic data (morphological, physiological and biochemical indicators) at different growth stages (germination and seedling stages) in different growth environments (field test and laboratory test). This method can be used to systematically, efficiently and accurately identify the drought resistance of sorghum based on the consistency of evaluation results by multiple comparison analysis, which is useful in the research on drought resistance mechanism and sorghum breeding for drought resistance.

multilevel phenotypic analysis; sorghum; drought resistance; germination stage; seedling stage

本研究由中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(Y2017PT25), 國家自然科學(xué)基金項目(31471558), 國家重點(diǎn)研發(fā)項目(2018YFD1000702)和國際原子能機(jī)構(gòu)協(xié)調(diào)研究項目(D23031)資助。

This study was supported by the Fundamental Research Funds for Central Non-profit Scientific Institution (Y2017PT25), the National Natural Science Foundation of China (31471558), the National Key R&D Program of China (2018YFD1000702), and the IAEA Coordinated Research Project (D23031).

李桂英, E-mail:liguiying@caas.cn; 朱莉, E-mail:zhuli01@caas.cn

E-mail: 1826437817@qq.com

2019-02-14;

2019-05-12;

2019-06-04.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190604.0842.002.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94022