莫俊愷 劉帥 朱曉媛 韋曉菊 黎繼烈,*

(1 中南林業(yè)科技大學林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室，長沙 410004；2 長沙凱曉生物科技有限公司，長沙 410006)

頭孢克洛(cefaclor)，化學名為(6R,7R)-7-[(R)-2-氨基-苯基乙酰氨基]-3-氯-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸一水合物，屬于第二代頭孢菌素。由美國Lilly公司研發(fā)[1]，其殺菌機制是阻礙細菌細胞壁的合成，對多種革蘭陽性菌、革蘭陰性菌均具有很強的殺滅作用[2]，臨床上主要用于皮膚及軟組織感染[3]。目前頭孢克洛工業(yè)生產(chǎn)多采用化學半合成法，包括酰氯法和混合酸酐法，反應(yīng)步驟多，條件苛刻，且污染嚴重[4]；而利用青霉素?；复呋铣深^孢克洛具有很好的選擇性，活性位點無需保護即可反應(yīng)，明顯縮減了反應(yīng)步驟，操作更加簡單，無毒害，成本低、收率高[5]，是一種具有良好應(yīng)用前景的綠色合成技術(shù)[6]，已經(jīng)成為了當今制藥的熱點。目前人們研究較多的是如圖1所示的用合成用固定化青霉素?；干a(chǎn)頭孢克洛。

本文中以7-ACCA為母核，D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽為側(cè)鏈，合成用固定化青霉素酰化酶為催化劑，催化合成頭孢克洛。通過對底物質(zhì)量濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH的調(diào)整和優(yōu)化，提供了較好的工藝線路，提高了反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率并且確保了酶的反應(yīng)批次及收率，也促進了酶法制備頭孢克洛的產(chǎn)業(yè)化。

圖1 合成用固定化青霉素?；府a(chǎn)頭孢克洛Fig.1 Production of cefaclor by synthetic immobilized penicillin acylase

1 材料與方法

1.1 材料

合成用固定化青霉素?；?湖南南北旺生物技術(shù)有限公司)；頭孢克洛標準品(江蘇蘇州中聯(lián)化學制藥有限公司)；7-ACCA、D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽(浙江普洛制藥有限公司)；其它試劑(市售分析純)。

1.2 方法

1.2.1 7-ACCA含量測定及轉(zhuǎn)化率、收率計算

(1)HPLC分析條件：

色譜柱：Hyperclone C18柱(250mm×4.60mm, 5μm)；流動相配制：稱取6.8g磷酸二氫鉀溶于1000mL純化水，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至3.4，用0.22μm濾膜過濾，取920mL加入80mL乙腈(92:8)，超聲脫氣20min左右；流速：1mL/min；檢測：UV檢測：254nm；樣品測定：取待測液0.5mL至50mL容量瓶，用純化水稀釋定容至刻度；進樣量：20μL。

(2)轉(zhuǎn)化率及收率計算：

轉(zhuǎn)化率=[1-轉(zhuǎn)化后7-ACCA殘留量/(轉(zhuǎn)化前7-ACCA殘留量)]×100%，殘留量(mol)；收率=轉(zhuǎn)化后頭孢克洛的生成/頭孢克洛的理論生成。

1.2.2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)

在合成反應(yīng)器中加入稱量好的合成用固定化青霉素?；?酶投入量與母核同質(zhì)量)，確定7-ACCA底物濃度，讓其溶解于水中，用氨水調(diào)節(jié)pH至8.0，待其溶解充分后投入合成反應(yīng)器中，溶解后的側(cè)鏈D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽(投入量為7-ACCA摩爾數(shù)的1.2倍)緩慢滴加入酶反應(yīng)體系(開始滴加后準確記錄反應(yīng)時間)，開啟攪拌，過程中用3mol/L氨水及6mol/L鹽酸自動控制pH，同時控制反應(yīng)溫度，反應(yīng)1h側(cè)鏈滴加完畢。取起始樣以及每隔1h取樣，進行HPLC分析，計算轉(zhuǎn)化率和收率。

1.2.3 分離精制

反應(yīng)結(jié)束后，用100目篩網(wǎng)分離酶和粗粉、清液，抽濾收集粗粉，抽濾后的清液再洗酶和粗粉，多次過濾，多次用清液洗酶，直至過篩清液基本澄清，過濾后清液清亮、色淺，酶回收套用。收集粗粉濕品后，20～30℃溶于清液，攪拌為無結(jié)塊的勻漿后，用鹽酸調(diào)pH1以下(0.5～0.7)，至粗粉全溶(溶解液外觀澄清透明)，加入活性炭攪拌脫色后抽濾，收集濾液。攪拌濾液，控制溫度15～20℃，加濃氨水調(diào)pH值1.0左右，加入少量晶種后繼續(xù)調(diào)pH1.5左右(開始析出，pH自然降到1.1左右)。再降溫至10℃，養(yǎng)晶0.5h，再繼續(xù)緩慢調(diào)pH至3.8(pH會上升到4.5左右)。降溫至5℃，攪拌養(yǎng)晶2h。抽濾結(jié)晶液，將濕粉35℃下真空干燥得到精品。通過精品與標準品的HPLC圖譜對比，得到兩者含量與雜質(zhì)的對比結(jié)論。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化率和收率的影響

將7-ACCA配成質(zhì)量濃度為160、170、180、190及200g/L的底物溶液，在相同的溫度15℃及pH6.0條件下分別進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC分析并計算轉(zhuǎn)化率和收率(圖2)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化率和收率隨著底物質(zhì)量濃度增加而降低，是因為在反應(yīng)過程中，較高的質(zhì)量濃度將產(chǎn)生高濃度的產(chǎn)物抑制作用，從而影響反應(yīng)，而較低的底物質(zhì)量濃度雖然不會抑制反應(yīng)，但最終產(chǎn)物濃度不高，更多的副產(chǎn)物、更高的分離成本將是十分嚴峻的問題，最終確定底物質(zhì)量濃度控制在170～190g/L內(nèi)效果最佳。

2.2 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率和收率的影響

控制溫度為10、15、20、25和30℃，在相同的底物濃度180g/L、pH6.0條件下分別進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC分析計算轉(zhuǎn)化率和收率(圖3)。結(jié)果顯示反應(yīng)溫度在15℃時，轉(zhuǎn)化率和收率最高，隨著溫度的繼續(xù)上升，轉(zhuǎn)化率開始下降。說明低溫使能耗增加，時間延長；而溫度過高，側(cè)鏈加速分解，從而使合成酶活力不穩(wěn)定。最終確定反應(yīng)溫度在10～20℃范圍內(nèi)效果最佳。

圖2 底物濃度對轉(zhuǎn)化率和收率的影響Fig.2 The effect of substrate concentration on the conversion rate and the yield

圖3 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率和收率的影響Fig.3 The effect of reaction temperature on the conversion rate and the yield

2.3 轉(zhuǎn)化pH對轉(zhuǎn)化率和收率的影響

控制pH5、5.5、6、6.5和7，在相同的溫度15℃及底物濃度條件180g/L條件下下分別進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC分析計算轉(zhuǎn)化率和收率(如圖4)。結(jié)果顯示pH6～7時均有較高的轉(zhuǎn)化率，當pH小于6或大于7時，轉(zhuǎn)化率和收率下降明顯。這是由于在堿性環(huán)境中會加快側(cè)鏈的分解速度，產(chǎn)物的穩(wěn)定性無法得到保證，導致影響最終收率。最終確定反應(yīng)最適pH在6.0～7.0范圍內(nèi)效果最佳。

2.4 酶法制備頭孢克洛響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

圖4 轉(zhuǎn)化pH對轉(zhuǎn)化率和收率的影響Fig.4 The effect of reaction pH on the conversion rate and the yield

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇以上3因素：底物濃度(A)、轉(zhuǎn)化溫度(B)、轉(zhuǎn)化pH(C)為影響因素，以反應(yīng)轉(zhuǎn)化率(Y)為響應(yīng)值。每個因素取3個水平以(-1、0、1)為編碼，用Box-Benhnken試驗設(shè)計，各因素及水平設(shè)計見表1，并依據(jù)表2的設(shè)計出的17組方案進行實驗，結(jié)果見表3。所得二次回歸擬合方程為：

結(jié)果如表3所示，本實驗所建立的模型中底物濃度(A)、轉(zhuǎn)化溫度(B)、轉(zhuǎn)化pH(C)以及B2、C2達到極顯著水平，A2達到顯著水平。模型P＜0.0001，失擬項P=0.0872＞0.05，表示模型極顯著、失擬項不顯著，表示上述方程對實驗的擬合度良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9893說明模型擬合度較好。

2.4.2 響應(yīng)面模型擬合及實驗驗證

如圖5～7所示，利用Design-Expert 8.0.6軟件繪出響應(yīng)面分析圖及其等高線，該圖可生動形象描繪各因素之間的關(guān)系。從響應(yīng)面圖來看，若圖形曲面的斜率越高(即坡度越大)說明該因素對轉(zhuǎn)化率的影響越顯著，當其中一個因素固定不變時，也可以看出另外兩個因素的交互作用對轉(zhuǎn)化率的影響；從等高線圖來看，其可以反映因素之間的相互作用，若等高線的形狀越接近圓形說明交互作用越弱，越接近橢圓形越強。

表1 Box-Benhnken 設(shè)計因素水平表Tab.1 Variables and levels in Box-Behnken design

表2 中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design format and data

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of variance for quadric regression model

根據(jù)軟件分析模型的最佳水平為：底物濃度175.81g/L、轉(zhuǎn)化溫度13.9℃、轉(zhuǎn)化pH6.43，可得轉(zhuǎn)化率理論最大值為98.2%。為檢查上述結(jié)果的可靠性，進行3次平行實驗，測得頭孢克洛轉(zhuǎn)化率為(98.2±0.3)%，與預(yù)測值相當接近，說明該模型可很好地反映試驗結(jié)果具有一定的可靠性。

2.5 合成用固定化青霉素酰化酶穩(wěn)定性檢測

在最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下(7-ACCA質(zhì)量濃度175.8g/L、溫度13.9℃、pH6.43)將合成用固定化青霉素?；富厥?，重復進行多批轉(zhuǎn)化反應(yīng)，利用高效液相色譜計算每批次轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化時間，對在最優(yōu)反應(yīng)體系下合成頭孢克洛的效果以及合成用固定化青霉素?；傅姆€(wěn)定性(如表4、圖8)進行驗證。由表4、圖8可以看到整個轉(zhuǎn)化反應(yīng)重復進行了126批次轉(zhuǎn)化合成反應(yīng)，在前46批次轉(zhuǎn)化合成反應(yīng)中，平均反應(yīng)時間在178min，平均轉(zhuǎn)化率高達97.8%；在47～86批次中平均反應(yīng)時間上升至206min，轉(zhuǎn)化率依略有下降；87～111批的結(jié)果與前一批結(jié)果基本相似；第112～126批次平均反應(yīng)時間顯著上升，平均轉(zhuǎn)化率也降至95.5%，原因主要是固定化酶長期回收使用后，內(nèi)部構(gòu)象產(chǎn)生了變化，部分酶分子與載體共價鍵斷裂，導致其活性下降。綜上，在最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下合成用固定化青霉素酰化酶穩(wěn)定性良好，在多批次反復使用后活力依舊可觀；同時計算出126批反應(yīng)批次中的平均轉(zhuǎn)化率高達97.1%，同時收率平均也達到了95%以上，驗證了此反應(yīng)體系對于酶法制備頭孢克洛的工藝優(yōu)化是可行的。

2.6 頭孢克洛精品與標準品的數(shù)據(jù)對比

通過轉(zhuǎn)化反應(yīng)與分離精制后得到頭孢克洛精品，已知頭孢克洛標準品含量約為99%，利用HPLC外標法得到頭孢克洛精品含量為：

圖5 底物濃度與轉(zhuǎn)化溫度的交互作用對轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of mass concentration of substrate and reaction temperature on the conversion rate

圖6 底物濃度與轉(zhuǎn)化pH的交互作用對轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of mass concentration of substrate and reaction pH on the conversion rate

圖7 轉(zhuǎn)化溫度與轉(zhuǎn)化pH的交互作用對轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of reaction temperature and reaction pH on the conversion rate

表4 多批次轉(zhuǎn)化酶活力衰減及轉(zhuǎn)化率情況Tab.4 The situation of energy attenuation and conversion rate of multiple batches of invertase

頭孢克洛精品含量=99%×[C(頭孢克洛標準品)×S(頭孢克洛精品)/C(頭孢克洛標精品)×S(頭孢克洛準品)，其中，C為濃度；S為液相圖譜中峰面積。

圖9～10分別為頭孢克洛精品與頭孢克洛標準品HPLC圖譜，確定濃度后可得：頭孢克洛標準品濃度30.11(mg/100mL)，頭孢克洛標準品液相圖譜峰面積7777.532；頭孢克洛精品濃度29.62(mg/100mL)，頭孢克洛精品液相圖譜峰面積7561.295。

綜上計算：頭孢克洛精品含量為98.7%，與標準品相差很小，根據(jù)圖譜對比可知雜質(zhì)殘留與標準品基本一致。

圖8 多批次轉(zhuǎn)化酶活力衰減及轉(zhuǎn)化率情況Fig.8 The situation of energy attenuation and conversion rate of multiple batches of invertase

3 結(jié)論與討論

圖9 精制后頭孢克洛精品HPLC圖譜Fig.9 The HPLC chromatogram of cefaclor boutiques after refined

圖10 頭孢克洛標準品HPLC圖譜Fig.10 The HPLC chromatogram of cefaclor standards

本實驗采用合成用固定化青霉素?；复呋负?-ACCA和側(cè)鏈苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽在水相體系中轉(zhuǎn)化合成頭孢克洛，利用HPLC對母核進行定量分析，追蹤母核7-ACCA轉(zhuǎn)化率。單因素實驗結(jié)果表明：在溫度10～20℃、pH6.0～7.0、底物濃度170～190g/L下，該實驗效果最佳。得到各單因素最優(yōu)范圍后，采用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法預(yù)測出最佳反應(yīng)條件為：底物濃度175.81g/L、轉(zhuǎn)化溫度13.9℃、轉(zhuǎn)化pH6.43，經(jīng)試驗驗證，測得7-ACCA酶法制頭孢克洛轉(zhuǎn)化率為(98.2±0.3)%，與預(yù)測值接近。通過精制后頭孢克洛精品與頭孢克洛標準品的HPLC圖譜對比與分析，可確認兩者含量與雜質(zhì)殘留基本一致。固定化酶酶法合成頭孢克洛避免了傳統(tǒng)化學合成方法中的有毒有害物質(zhì)，且工藝路線簡單，條件溫和，轉(zhuǎn)化時間短，而且獲得了較高的轉(zhuǎn)化率，同時合成用固定化青霉素酰化酶具有可多次重復使用等優(yōu)點。該工藝為進一步放大研究和中試乃至工業(yè)生產(chǎn)打下了堅實基礎(chǔ)，也將會對酶法合成抗生素的發(fā)展產(chǎn)生深遠影響。