鄭紅蕓 吳越 葉景靜 盧覃培 李飛娜 陳建宏 蔣蓮秀 劉少偉 何義 孫承航,* 黃大林,*

(1 桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，桂林 541004；2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

臨床不斷出現(xiàn)的耐藥細(xì)菌迫切需要新抗生素，抗生素的直接來(lái)源為微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，如超過(guò)40%的次級(jí)代謝產(chǎn)物由放線菌產(chǎn)生[1-2]。由于從普通陸地來(lái)源微生物中發(fā)現(xiàn)新活性次級(jí)代謝產(chǎn)物越來(lái)越困難，迫使我們從以前研究較少的海洋[3]、熱泉[4-5]、紅樹(shù)林[6]、沙漠[7-8]、極地[9]等特殊環(huán)境中尋找產(chǎn)生新抗生素的藥用微生物資源。

紅樹(shù)林微生物資源豐富且多樣新穎，據(jù)統(tǒng)計(jì)，1998—2017年2月，分離自紅樹(shù)林植物、沉積物及土壤或淤泥內(nèi)的放線菌新物種數(shù)量達(dá)73個(gè)以上[10]，為我們篩選發(fā)現(xiàn)活性次級(jí)代謝產(chǎn)物提供了豐富新穎的微生物資源。廣西紅樹(shù)林資源豐富，占全國(guó)紅樹(shù)林面積的25.47%[11]。其中真紅樹(shù)植物有白骨壤、桐花樹(shù)、秋茄、紅海欖、木欖、海漆、老鼠簕、銀葉樹(shù)和無(wú)瓣海桑(引種)，還包括半紅樹(shù)植物及伴生植物(茅尾海紅樹(shù)林的伴生植物為互花米草[12])。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)廣西北侖河口國(guó)家紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)的紅樹(shù)林根圍淤泥放線菌[13-14]進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了一些具有抗菌及抗腫瘤活性的放線菌潛在新物種。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，廣西茅尾海紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)植物根圍淤泥中放線菌的研究很少，為此，本研究針對(duì)廣西欽州茅尾海紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)中的堅(jiān)心圍與康熙嶺片區(qū)開(kāi)展了放線菌多樣性、新穎性和抗菌活性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

2017年9月，從廣西茅尾海紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)(省級(jí))的堅(jiān)心圍與康熙嶺片區(qū)不同紅樹(shù)植物根圍下10cm左右采集8份淤泥樣品于保鮮袋內(nèi)并在一周內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，在4℃冰箱內(nèi)保存，樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)10種分離培養(yǎng)基及其配方：M1(棉子糖組氨酸培養(yǎng)基)：棉子糖5g，L-組氨酸1g，KNO31g，NaCl 1g，CaCl22g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 1g，瓊脂20g，海水600mL，蒸餾水400mL，pH7.2。

M2(ISP2培養(yǎng)基)：葡萄糖4g，酵母粉4g，麥芽浸粉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2。

M3(GPT)：葡萄糖10g，蛋白胨5g，胰蛋白胨3g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4。

M4(改良的高氏二號(hào)培養(yǎng)基)：葡萄糖1g，蛋白胨0.1g，胰蛋白胨0.06g，NaCl 0.5g，海水500mL，蒸餾水500mL，pH7.2。

M5(海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基)：海藻糖5g，脯氨酸1g，(NH4)2SO41g，NaCl 1g，CaCl22g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 1g，復(fù)合維生素1mL，瓊脂18g，土壤浸汁30mL，海水500mL，蒸餾水500mL，pH 7.2。

M6(R2A培養(yǎng)基)：BD公司合成培養(yǎng)基18.2g，土壤浸汁30mL，海水500mL，蒸餾水500mL，pH7.2。

M7(ISP7培養(yǎng)基)：甘油15g，L-酪氨酸0.5g，L-天冬氨酰1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，微量元素1mL，瓊脂15g，海水400mL，蒸餾水600mL，pH7.2。

M8(M9培養(yǎng)基)：精氨酸1.0g，甘油6mL，復(fù)合維生素1mL，微量鹽1mL，瓊脂15g，土壤浸汁30mL，海水400mL，蒸餾水600mL，pH7.2。

M9[淀粉酪素培養(yǎng)基(篩選嗜鹽或耐鹽菌)[15-16]]：可溶性淀粉10g，干酪素0.3g，KNO32g，MgSO4·7H2O 0.05g，NaCl 30g，K2HPO42g，CaCO30.02g，F(xiàn)eSO410mg，瓊脂15g，土壤浸汁30mL，蒸餾水1000mL，pH7.2。

M10(ISP5培養(yǎng)基)：L-天門冬酰胺1g，甘油10g，K2HPO41g，微量鹽1mL，瓊脂15g，土壤浸汁30mL，蒸餾水1000mL，pH7.2。

(2)純化用培養(yǎng)基：ISP2和R2A瓊脂培養(yǎng)基。

(3)發(fā)酵選擇性培養(yǎng)基：ISP2和R2A液體培養(yǎng)基。

(4)檢定菌培養(yǎng)基：Mueller-Hinton(M-H)培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid)用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌、白念珠菌和羅倫隱球菌。腸球菌用BHI培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid)培養(yǎng)。

表1 紅樹(shù)林植物根圍淤泥樣品信息Tab.1 Information of samples collected from mud of mangrove plant rhizophere

1.1.3 抑制劑

雜菌抑制劑選用放線菌酮、重鉻酸鉀和萘啶酮酸，終濃度分別為50.0、25.0和25.0mg/L。待培養(yǎng)基溫度降到50℃左右時(shí)滴入并混勻。

1.1.4 檢定菌株

敏感菌株與耐藥菌株[17]：銅綠假單胞菌敏感株(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853和耐藥株2774、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)敏感株ATCC25923和耐藥株ATCC43300、大腸埃希菌(Escherichia coli)敏感株ATCC25922和耐藥株2800、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)敏感株ATCC10031和耐藥株ATCC700603、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)敏感株ATCC33186、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)敏感株ATCC19606和 耐藥株2799，以上菌株均為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所保藏；腸球菌(Enterococcus faecalis)耐藥株VRE310681由廣東汕頭大學(xué)提供；真菌：白色念珠菌(Candida albicans)CCTCC93025和羅倫隱球菌(Cryptococcus laurentii)CCTCC91013購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.5 儀器及試劑

PCR引物(27F, 1492R)與萘啶酮酸購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；DNA提取用Chelex100樹(shù)脂購(gòu)于美國(guó)BioRad公司；2×EasyTaqSupermix、放線菌酮購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Autoclave MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司；ABI Veriti96-well fast thermal cycler PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；YT-CJ-1ND超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器有限公司；小型離心機(jī)Centrifuge1-14，德國(guó)Sigma公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀OSB-2100，日本Eyela公司；電泳儀DYY-6C，北京市六一儀器廠；全恒溫培養(yǎng)箱ZDP-2120和旋轉(zhuǎn)式搖床ZHWY-211C，上海智城分析儀器制造公司。

1.2 菌株獲得及活性檢測(cè)方法

1.2.1 土壤樣品的處理和涂布

參考吳越等[13]樣品處理方法，將新鮮根圍淤泥放于無(wú)菌平皿中并作好標(biāo)記，室溫條件超凈臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干后，用無(wú)菌研缽處理干泥塊成粉末狀。分別稱取不同地點(diǎn)的土樣粉末5g于45mL無(wú)菌水中溶解，加入無(wú)菌玻璃珠，180r/min，28℃搖床回旋振蕩6h；靜置后，吸取1mL土樣懸液于9mL無(wú)菌水中，然后10倍稀釋成4個(gè)梯度，選擇終濃度為10-2、10-3和10-4g/mL的樣品，分別吸取0.2mL于10種不同分離培養(yǎng)基平皿內(nèi)，進(jìn)行涂布，打包后，置28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的分離純化與保存

分離菌株：培養(yǎng)1～3周左右并觀察菌落的形態(tài)以及生長(zhǎng)情況，判斷形態(tài)似放線菌的可見(jiàn)菌落進(jìn)行標(biāo)記，然后用竹簽挑取單菌落于改良ISP2固體培養(yǎng)基 或R2A培養(yǎng)基內(nèi)劃線純化，直至得到單菌落。

菌株的保存：純化菌株轉(zhuǎn)接于牛奶管，凍干后于4℃貯存；轉(zhuǎn)接于20%甘油保存于-20℃。

1.2.3 16S rRNA基因序列的測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

(1)Chelex-100法[18]提取基因組DNA，純化菌株參考Walsh等[19]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反應(yīng)體系：引物量均為1.5μL；底物為1.5μL；2×EasyTaqsupermix 25μL；ddH2O 20.5μL；總體積50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃復(fù)性1min，72℃延長(zhǎng)2min，35個(gè)循環(huán)完成，72℃后延長(zhǎng)10min。

(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證后，擴(kuò)增片段在1400～1500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

(3)登錄EzBiocloud和NCBI兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)。將高相似率且有效發(fā)表的菌株的16Sr RNA作為參比對(duì)象，然后采用Clustal W[20]進(jìn)行多序列聯(lián)配，用MEGA 7.0軟件[21]采用鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[22]，系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura-2-parameter[23]模型估計(jì)，重復(fù)取樣1000次進(jìn)行自展值(bootstrap value)分析以此來(lái)評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性。

1.2.4 發(fā)酵粗提物抗菌活性檢測(cè)

(1)待測(cè)液的制備：篩選出的發(fā)酵菌株生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期時(shí)接種于裝有ISP2液體培養(yǎng)基130mL的500mL錐形瓶中，每株接種3瓶，培養(yǎng)條件為：28℃持續(xù)培養(yǎng)6～7d，搖床轉(zhuǎn)速180r/min。高速離心后得到的上清液，使用乙酸乙酯萃取2次，旋蒸濃縮后，適量甲醇溶解回收；水相與菌絲體丙酮浸泡上清液在干燥后用適量的50%甲醇溶液溶解回收備用。

(2)檢定菌培養(yǎng)皿的制備：分別接種檢定菌于MH和BHI兩種液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：搖床設(shè)36℃、180r/min，持續(xù)培養(yǎng)12h。待無(wú)菌的MH和BHI瓊脂培養(yǎng)基溫度降至55℃左右，將生長(zhǎng)適宜的菌液按0.8%的比例濃度加入并進(jìn)行調(diào)試，倒入平板后，待其凝固并做標(biāo)記，置4℃低溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

(3)待測(cè)液抗菌活性的檢測(cè)：將有機(jī)相、水相和菌絲體丙酮浸泡液3類待測(cè)液分別滴加到直徑為6mm的無(wú)菌濾紙片上，分兩次操作完成。10μL左氧氟沙星溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，甲醇溶劑作為陰性對(duì)照，待加樣紙片干燥后貼于檢定菌培養(yǎng)皿中，36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24h后觀察抑菌效果并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果

2.1 廣西茅尾海紅樹(shù)林可培養(yǎng)放線菌多樣性分析

對(duì)361株具有放線菌形態(tài)特征的菌株排重后，通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序分析，共篩選獲得244株放線菌，分屬于5個(gè)目14個(gè)科29個(gè)屬，見(jiàn)表2和圖1。

8個(gè)不同采樣地點(diǎn)淤泥來(lái)源放線菌的多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)與均勻度指數(shù)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3，采樣點(diǎn)S5、S6和S7的Pielou指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon-winner指數(shù)幾乎呈相同的變化趨勢(shì)；采樣點(diǎn)S3、S4、S5、S6、S7和S8之間在多樣性上差異較小，多樣性指數(shù)也較高，說(shuō)明這6個(gè)采樣點(diǎn)物種豐富度相對(duì)較高，明顯優(yōu)于采樣點(diǎn)S1和S2；S6采樣點(diǎn)和S7采樣點(diǎn)均分離獲得了8個(gè)屬，在多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和均勻度指數(shù)上無(wú)明顯差異。

2.2 廣西茅尾海紅樹(shù)林可培養(yǎng)放線菌新穎性分析

經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株K7A10-207、S4B6-851、K6A10-57、K7B1-327分別與有效發(fā)表菌株Arthrobacter pascensDSM 20545T(X80740)、Amnibacterium kyonggienseKSL51201-037T(FJ527819)、Streptomyces polymachusT258T(KM229363)、Lysinimicrobium pelophilumNBRC 109393T(BBLY01000002)的相似率為97.77%、97.78%、98.30%和98.52%，特別值得注意的是菌株S4B6-851，在鄰接法建樹(shù)中，其與微桿菌科Amnibacterium屬中的有效發(fā)表菌株聚成一簇，形成獨(dú)立的進(jìn)化分支(圖2)，極可能為一株Amnibacterium屬的新物種，該屬內(nèi)目前有Amnibacterium kyonggienseKSL51201-037T(FJ527819)、Amnibacterium endophyticum1T4Z-3T (MG065698)、Amnibacterium soliMB78T(EU432172)3個(gè)物種，分別于2011年[24]、2013年[25]和2018年[26]報(bào)道，針對(duì)該物種，將開(kāi)展多相分類學(xué)工作。

表2 244株放線菌的多樣性分布情況Tab.2 Biodiversity and distribution of 244 actinobacteria strain

圖1 紅樹(shù)林來(lái)源部分代表性分離菌株通過(guò)16S rRNA基因序列構(gòu)建的與相近種之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Nerghbour-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationships between representative strains and their closely related type strains from mangrove rhizosphere mud

2.3 廣西茅尾海紅樹(shù)植物根圍土壤樣品中放線菌在不同培養(yǎng)基中的分布情況

244株放線菌在不同培養(yǎng)基上的分布情況如圖3～4所示。10種選擇性培養(yǎng)基中，設(shè)計(jì)添加土壤浸汁的10號(hào)培養(yǎng)基分離到的菌株數(shù)最多，其次為添加海水的7號(hào)培養(yǎng)基。在8份樣品中，堅(jiān)心圍片區(qū)內(nèi)桐花樹(shù)下的根圍土壤8號(hào)樣品分離出的菌株數(shù)最多。其次為康熙嶺片區(qū)內(nèi)互花米草下的根圍土壤7號(hào)樣品分離出的菌株數(shù)較多，康熙嶺片區(qū)內(nèi)無(wú)瓣海桑根際下土壤2號(hào)樣品和互花米草下根圍土壤5號(hào)樣品分離出的菌株數(shù)則較少，分別為7株和6株。

2.4 83株放線菌抗菌活性初篩結(jié)果

根據(jù)培養(yǎng)及形態(tài)特征、16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果及文獻(xiàn)查閱，從244株放線菌中挑選出83株菌進(jìn)行發(fā)酵、萃取，對(duì)菌株發(fā)酵液的酯相、水相和菌絲丙酮萃取相，共3類樣品展開(kāi)抗菌活性篩選。只要有一類樣品抑菌圈直徑＞0.70cm即計(jì)為陽(yáng)性結(jié)果?；钚匝芯拷Y(jié)果表明共59株放線菌呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，如圖5所示。其中有6株放線菌具有廣譜的抗菌活性，抑菌圈直徑均大于0.70cm，最大抑菌圈達(dá)2.37cm。1株北里孢菌屬僅對(duì)腸球菌產(chǎn)生了抗菌活性，而且抗菌活性較好，抑菌圈直徑達(dá)1.33cm。潛在新穎放線菌K7B1-327對(duì)銅綠假單胞菌具有抗菌活性，抑菌圈直徑為0.86cm。其余活性菌株抗菌活性大部分集中在乙酸乙酯相。

3 結(jié)論和討論

表3 不同采樣點(diǎn)放線菌相關(guān)多樣性指數(shù)分析Tab.3 Analysis of actinobacteria diversity index at different sampling points

圖2 通過(guò)16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株S4B6-851與其相近種的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Neighbour-Joining tree showing the phylogenetic relationships between strain S4B6-851 and its closely related type strains based on 16S rRNA gene sequences

圖3 不同樣品和培養(yǎng)基中分離得到的放線菌數(shù)量Fig.3 Actinobacterial strains from different samples and different media

圖4 不同培養(yǎng)基分離得到的放線菌屬Fig.4 Diversity of actinobacteria isolated from different media

我國(guó)廣西壯族自治區(qū)位于北回歸線以南，南瀕北部灣、面向東南亞，西南與越南毗鄰，紅樹(shù)林分布東起合浦山口，西至東興北侖河口的整個(gè)海岸帶。而廣西茅尾海紅樹(shù)林位于欽州市的欽南區(qū)和欽州港區(qū)[27]，包括堅(jiān)心圍、康熙嶺、七十二涇和大風(fēng)廠四個(gè)片區(qū)[28]，是我國(guó)最大最典型的島群紅樹(shù)林和巖灘紅樹(shù)林，面積約1892hm2[29]。2005年自治區(qū)人民政府為保護(hù)南亞熱帶河口、港灣和海岸灘涂濕地生態(tài)系統(tǒng)，特建立了茅尾海紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)。其中，樣品采集地點(diǎn)康熙嶺片區(qū)紅樹(shù)林植物群落較為豐富，包括真紅樹(shù)植物無(wú)瓣海桑、桐花樹(shù)及伴生植物互花米草。而在堅(jiān)心圍片區(qū)樣品采集地點(diǎn)只存在桐花樹(shù)群落。

圖5 部分發(fā)酵菌株對(duì)檢定菌株抑菌效果Fig.5 The partly important results of antibacterial assay

在多樣性方面，吳家法等[30]從茅尾海紅樹(shù)林采集的25份樣品中分離出放線菌117株，分布于6個(gè)目10個(gè)科19個(gè)屬。本次研究從8份樣品中共獲得了244株放線菌，分布于5個(gè)目13個(gè)科29個(gè)屬。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)本次分離篩選到的放線菌屬較之前豐富，獲得了之前未分離到的放線菌屬18個(gè)。由此分析可以得出，茅尾海紅樹(shù)林淤泥中的放線菌資源豐富。同時(shí)，不同且大量的放線菌被分離與篩選，不僅豐富了抗菌活性篩選菌株，也為我們挖掘新抗生素類活性物質(zhì)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在新穎性方面，進(jìn)行本次研究之前，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，吳家法、姜明國(guó)和龔斌等[30-32]在茅尾海紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)紅樹(shù)林發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬、小單孢菌屬、分枝桿菌屬等屬的潛在新菌株。而此次在堅(jiān)心圍和康熙嶺片區(qū)的研究中，經(jīng)16S rRNA序列比對(duì)和建樹(shù)后發(fā)現(xiàn)了4株潛在的放線菌新物種Arthrobacter(K7A10-207)、Amnibacterium(S4B6-851)、Lysinimicrobium(K7B1-327)和Streptomyces(K6A10-57)，相似率都低于98.65%。為此，我們可以對(duì)這4株放線菌菌株開(kāi)展分類學(xué)研究。

在稀有放線菌方面[33]，除了以上提到的潛在新菌株Amnibacterium(S4B6-851)、Lysinimicrobium(K7B1-327)，還包括放線異壁酸菌屬(Actinoallomurus)和球狀孢囊菌屬(Sphaerisporangium)都是本次分離獲得的稀有菌屬。其中放線異壁酸菌屬屬于鏈孢囊菌科，是最近十年內(nèi)被相繼發(fā)現(xiàn)的，隨后研究者對(duì)該屬菌株進(jìn)行了研究，現(xiàn)已獲得具有抗菌活性的醌類化合物[34]及聚醚類化合物[35]；另外，日本學(xué)者從球孢囊菌屬菌株Sphaerisporangiumsp.33226中獲得了MBJ-0086和MBJ-0087這兩種新雙環(huán)縮肽[36]。本研究獲得的稀有放線菌為我們篩選新型抗生素提供了優(yōu)質(zhì)菌株。