鄭德波，鄒成林，譚 華，翟瑞寧，莫潤秀，黃愛花，黃開健

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所 廣西 南寧 530007）

【研究意義】玉米穗粒腐病是世界上普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的真菌性病害，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，已逐步上升為玉米生產(chǎn)上的主要病害［1］，也是廣西最常見的玉米真菌病害之一［2］。玉米穗粒腐病一般品種發(fā)病率為5%～10%，感病品種發(fā)病率可高達(dá)50%左右［3-4］。玉米穗粒腐病致病菌有20多種，在我國主要是由擬輪枝鐮孢菌（串珠鐮孢菌）［5］和禾谷鐮孢菌引起的［6］。選育和種植抗穗腐病玉米品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的防治方法［1］。近年來，由于異常氣候的影響，玉米種植區(qū)穗腐病有不斷加重趨勢。穗粒腐病的抗性已成為玉米品種審定中的一個重要指標(biāo)，廣大育種者應(yīng)高度重視選育抗穗腐病的玉米品種。因此，深入研究玉米穗腐病的病因、病原菌種類、抗病機(jī)制、抗性基因等對創(chuàng)制抗病新材料及培育新品種具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】近年來，對于玉米穗粒腐病的研究，國內(nèi)外研究者多側(cè)重于其抗性遺傳規(guī)律方面。以經(jīng)典遺傳學(xué)研究為基礎(chǔ)，分子生物學(xué)手段的運(yùn)用為穗粒腐病抗性遺傳規(guī)律的研究帶來了極大的便利。Pérez-Brito等選用來自墨西哥高原的兩個抗病自交系分別與同一個感病自交系雜交，構(gòu)建了分別包含238、206個F2:3家系的2個作圖群體，采用針刺法接種鑒定各家系的穗粒腐病抗性，在兩個群體中分別找到7個和9個籽?？剐缘腝TL，這些QTL中包括兩個群體中共有的QTL位點(diǎn)3個（其中1個在第3染色體上，另外2個在第6染色體上），分別可以解釋4%～10%的表型變異［7］。Robertson-Hoyt等利用來自美國種質(zhì)資源的2份抗病材料GE440 和NC300，分別與感病材料FR1064和B104構(gòu)建了2個作圖群體，在抗病自交系GE440和NC300中分別找到7個和5個抗病QTL，分別在第2、4、5染色體上檢測到共同的抗病QTL，表型變異貢獻(xiàn)率介于4.4%～5.8%之間［8-9］。張帆等利用抗病材料R15進(jìn)行穗粒腐病抗性遺傳研究，通過多年多點(diǎn)試驗(yàn)，在雅安和綿陽兩個點(diǎn)檢測到2個共同的抗病QTL（分別位于第6和第9染色體上），分別可以解釋 18.7%～26.4% 的表型遺傳變異［10］。Ding等檢測到位于第3染色體著絲點(diǎn)附近多年多環(huán)境間穩(wěn)定遺傳的抗病QTL［11］。Li等利用抗病自交系BT-1和感病自交系N6構(gòu)建的250個RIL群體進(jìn)行玉米抗鐮孢菌穗粒腐病的QTL定位，發(fā)現(xiàn)了分別位于第3、4、5、6染色體上的4個QTL，分別能解釋2.5%～10.2%的表型變異［12］。Chen等用抗病自交系BT-1和感病自交系Xi502組配的包含210個家系的F2:3群體對玉米鐮孢菌穗粒腐病抗性進(jìn)行QTL定位，檢測到3個QTL，分別位于第4、5、10染色體上，其中位于第4染色體上的QTL能解釋17.95%的表型變異。在第4染色體4.05/4.06bin區(qū)段，以感病親本Xi502為輪回親本獲得 的NIL群體中，雜合植株的抗病率比純合植株提高 33.7%～35.2%［13］。Chen等通過 GWAS方法在3個不同環(huán)境下對818份玉米熱帶材料的穗腐病抗性進(jìn)行分析，鑒定出與鐮孢穗腐病抗性顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)45個，這些SNP位點(diǎn)對穗粒腐病抗性的效應(yīng)均表現(xiàn)為較小的加性效應(yīng)，單個SNP位點(diǎn)的表型變異貢獻(xiàn)率分別為1%～4%。整合GWAS分析結(jié)果和穗粒腐病抗性QTL分析結(jié)果，檢測到位于第2、3、4、5、9、10染色體上的8個共同位點(diǎn)（第4、5染色體上分別有2個，其余4條染色體上均為1個），其中第2、9染色體上的位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)［14］。Maschietto等用抗性親本CO441和感病親本CO354構(gòu)建的188個F2:3家系對玉米輪枝鐮孢菌穗粒腐病的QTL定位和候選基因分析，共檢測到15個穗粒腐病抗性QTL，并篩選出24個抗病候選基因［15］。此外，一些研究者也已開展了穗粒腐抗性基因發(fā)掘及抗病機(jī)制相關(guān)的研究。Liu等通過對兩個近等基因系轉(zhuǎn)錄組的分析,發(fā)現(xiàn)了乙烯合成、病程相關(guān)蛋白、信號途徑基因等與抗病相關(guān)的基因［16］。Wang等則通過對侵染擬輪枝鐮孢菌的抗感玉米材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)一些中間產(chǎn)物參與了由擬輪枝鐮孢菌誘發(fā)的穗腐病抗病分子機(jī)制，如小分子熱激蛋白、次級代謝物、脫落酸、茉莉酸等，為研究穗粒腐病的抗病機(jī)制提供了方向［17］。

【本研究切入點(diǎn)】目前廣西等南方一年兩熟玉米種植區(qū)尚未有正式的玉米穗粒腐病抗性QTL定位的相關(guān)文獻(xiàn)報道。相對一年一熟的玉米種植區(qū)，廣西等一年兩熟玉米種植地區(qū)連作程度高［18］，且感病敏感期具備適宜發(fā)病的溫度濕度條件［3］，更利于穗粒腐病的發(fā)生，且越來越嚴(yán)重，因而對這些區(qū)域玉米安全生產(chǎn)的危害更嚴(yán)重?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在這些地區(qū)開展玉米穗粒腐病抗性QTL定位研究，揭示玉米穗粒腐病抗性遺傳變異的規(guī)律，為這些區(qū)域的玉米穗粒腐病抗性育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以感病自交系掖478（Ye478）為母本、抗病自交系 CML171為父本構(gòu)建包含215個家系的F2∶3群體為試驗(yàn)材料。掖478和CML171均為本研究室種植觀察多年的自交系。掖478是國內(nèi)穗粒腐病抗性鑒定的感病對照，自然發(fā)病相當(dāng)嚴(yán)重［6，19］；CML171則較抗穗粒腐病，接種也感病較輕。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

2017年早造在明陽基地試驗(yàn)地種植掖478和CML171，雜交后獲得 F1代植株和F2代種子；同年晚造種植F2，F(xiàn)2群體單株套袋自交獲得F2∶3群體。掖478、CML171和雜交后獲得F1代苗期取樣提取DNA用于SSR引物的篩選，F(xiàn)2群體苗期取樣提取DNA用于多態(tài)性SSR引物多態(tài)性檢測。2017 年晚造在明陽基地試驗(yàn)田種植F2種子，對F2單株進(jìn)行嚴(yán)格套袋自交獲得包含215個家系的F2:3群體進(jìn)行性狀測定并完成QTL定位。2018年早造種植2個親本，F(xiàn)1及F2:3家系，田間人工接種輪枝鐮孢菌，觀察記載各家系內(nèi)各單株的病級。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，2次重復(fù)，行長3 m，行寬70 cm，株距25 cm。田間管理標(biāo)準(zhǔn)與普通大田生產(chǎn)相同。

1.3 性狀測定

在吐絲后10 d采用針刺法人工接種擬輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioides,本所植保研究室杜青分離培養(yǎng)后提供),接種后45 d進(jìn)行田間抗病性鑒定?？共⌒园从衩姿肓８】剐匀珖y(tǒng)一記載標(biāo)準(zhǔn)分單株記載家系內(nèi)各單株病級。根據(jù)病級計算各個家系的病情指數(shù), 抗病指數(shù)=1-病情指數(shù)。

1.4 SSR分析和QTL分析

苗期分別取兩個親本及其F1、F2各單株幼嫰葉片，參照CTAB法［20］提取葉片DNA；在前人玉米抗穗粒腐病QTL定位研究的基礎(chǔ)上，在MaizeGDB網(wǎng)站（http://www.maizegdb.org）的IBM2005圖譜中選擇均勻覆蓋玉米全基因組的452對已發(fā)表的SSR分子標(biāo)記，利用抗、感病親本篩選多態(tài)性好的標(biāo)記，最終篩選出覆蓋全基因組、多態(tài)性好的分子標(biāo)記148對［21］，用這些多態(tài)性標(biāo)記對作圖群體內(nèi)各單株進(jìn)行基因型分析，用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；將F2群體各單株在各多態(tài)性標(biāo)記間的基因型數(shù)據(jù)按要求整理好，運(yùn)行Mapmaker 3.0軟件，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜［22］，根據(jù)Mapmaker 3.0的最終結(jié)果，用Mapchart 2.3軟件繪制連鎖圖譜［23］。

根據(jù)抗病指數(shù)計算公式將群體內(nèi)各家系內(nèi)各單株的病級轉(zhuǎn)化為各家系的抗病指數(shù)，結(jié)合構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，利用winQTLCart 2.5［24］軟件中的復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行抗病指數(shù)的QTL定位。定位過程中，抗病指數(shù)在α= 0.05顯著水平下進(jìn)行500次排列檢驗(yàn)，確定其QTL的LOD閾值，軟件各主要參數(shù)設(shè)置如下：窗口大小=10 cM；步長=1 cM；背景控制：正向-反向逐步回歸法；背景標(biāo)記個數(shù)：5。計算得到抗病指數(shù)QTL的LOD閾值為2.2，從而選擇LOD值≥2.2來判斷是否存在QTL，并計算各QTL的表型變異貢獻(xiàn)率。QTL作用方式依據(jù)Stuber等［25］提出的顯性度判別標(biāo)準(zhǔn)來確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

田間接種鑒定調(diào)查結(jié)果（表1）表明，抗病親本CML171抗病指數(shù)為0.75，表現(xiàn)為抗；而感病親本掖478抗病指數(shù)為0.33，表現(xiàn)為感；兩親本的抗病性存在明顯差異。運(yùn)用DPS軟件V16.05［26］對抗病指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。方差分析結(jié)果顯示，兩重復(fù)間差異不顯著；215個F2:3家系間差異極顯著。對215個F2:3家系抗病指數(shù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn), 發(fā)現(xiàn) F2:3群體抗病指數(shù)正態(tài)曲線χ2值不顯著,符合正態(tài)分布,可用于QTL定位研究。

表1 抗病指數(shù)方差分析結(jié)果Table 1 Result of disease resistance index variance analysis

2.2 分離群體連鎖圖譜構(gòu)建

共篩選出148對抗感親本間多態(tài)性良好的SSR標(biāo)記，進(jìn)行 F2分離群體單株基因型分析，最終構(gòu)建出整合了這148對多態(tài)性SSR位點(diǎn)的遺傳連鎖圖譜（圖 1）。本研究中所構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜全長1 396.3 cM，標(biāo)記間的平均間距為9.43 cM。148個標(biāo)記在10條染色體上的分布并不均勻，以第1染色體標(biāo)記數(shù)目最多（21個）、長度最長（211 cM），第4染色體標(biāo)記數(shù)目則最少（9個）、長度也最短（94.6 cM）。10條染色體上標(biāo)記間平均間距在6.71 ～12.36 cM之間。標(biāo)記間平均間距第9染色體上最?。?.71 cM），第7染色體上最大（12.36 cM）。該連鎖圖譜存在2個間距較大的區(qū)間（大于30 cM），分別是第3染色體的umc1489～umc2081間和第5染色體的bnlg1700～phi109188間。各標(biāo)記在各染色體上的順序與IBM2005圖譜基本一致。

圖1 F2分離群體遺傳連鎖圖譜Fig.1 Genetic linkage map of F2 population

2.3 抗病指數(shù)QTL定位結(jié)果及效應(yīng)分析

采用復(fù)合區(qū)間作圖法對F2:3群體各家系抗病指數(shù)進(jìn)行QTL檢測和基因效應(yīng)分析，共檢測到分別位于第2、3、10染色體上的抗病QTL3個(圖2，表2)，其標(biāo)記區(qū)間分別為phi96100～umc1555、umc1399～umc1489和umc1380～phi083。單個QTL的表型貢獻(xiàn)率為4.6%～6.6%。基因作用方式分別為超顯性、超顯性和部分顯性。各QTL的加性效應(yīng)值有正有負(fù)，說明抗感親本中均含有微效抗病基因。

圖2 抗病指數(shù)QTL在染色體上的分布情況Fig.2 Distribution of disease resistance index QTL on chromosomes

表2 抗病指數(shù)QTL分析Table 2 QTL analysis of disease resistance index

3 討論

3.1 玉米抗穗粒腐病遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

對比前人抗穗粒腐病QTL定位研究發(fā)現(xiàn)，連鎖圖譜的構(gòu)建大多以經(jīng)典的F2分離群體為主［7-10,14-15］，也有用RIL群體等穩(wěn)定群體的報道［11-12］。本研究連鎖圖譜的構(gòu)建采用F2分離群體。相對其他穩(wěn)定的群體，F(xiàn)2群體具有構(gòu)建方法簡單、構(gòu)建周期短等優(yōu)勢，是進(jìn)行初級定位的首選。但其定位的精度較低，不適合精細(xì)定位等研究。前人的抗穗粒腐病QTL定位研究以SSR標(biāo)記為主，也有AFLP、RFLP或SNP標(biāo)記等與SSR標(biāo)記相結(jié)合的報道［10,15］，本研究選用SSR標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜。SSR標(biāo)記在玉米染色體組上的分布較廣，數(shù)量較多，檢測方式相對簡單，成本較低，是QTL定位研究的理想標(biāo)記。但其也存在一些缺點(diǎn)，如其基因型檢測自動化程度不高、在染色體組上分布不均，有些區(qū)域存在較大的間隔（大于30 cM）,大大降低了QTL的檢出效率和檢出機(jī)率。近年來，測序技術(shù)和基因芯片技術(shù)日趨成熟，為SNP標(biāo)記的開發(fā)和自動化檢測提供了技術(shù)保障。與SSR標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記在玉米染色體組上的分布更廣，數(shù)量更多且分布率極高，檢測自動化程度高，檢測成本也越來越低［27］，必將在QTL定位研究中逐漸取代SSR標(biāo)記。前人類似的研究結(jié)果顯示，雖然研究者所用標(biāo)記的類型和數(shù)量各不相同，所構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜的總長度也不相同，但標(biāo)記間的平均圖距大多為10 cM左右［10-11,13］。本研究構(gòu)建的連鎖圖譜標(biāo)記數(shù)目、圖譜全長與Chen等［13］的研究相當(dāng)，平均圖距9.43 cM，滿足初級QTL定位的基本條件。

3.2 玉米抗穗粒腐病QTL分析

前人的QTL定位結(jié)果表明，在不同的環(huán)境條件下，不同群體玉米抗穗粒腐病QTL在玉米10條染色體上均有分布，相同染色體上不同研究所定位到的QTL位置也不盡相同，各QTL對表型的貢獻(xiàn)率也不盡相同［7-15］。由此可見，玉米穗粒腐病抗性是一個極其復(fù)雜的、受微效多基因控制的數(shù)量性狀。相對于同類研究，本研究中僅僅定位到3個效應(yīng)較小的QTL，還有很多QTL沒有定位到，其主要原因可能在于：染色體的某個區(qū)段雖存在穗粒腐病抗性的QTL，但親本CML171和掖478在該QTL的等位基因差異不顯著；或者兩親本在該QTL的等位基因存在顯著差異，但其遺傳效應(yīng)較小，易受環(huán)境影響而無法檢測到，亦或是該QTL位點(diǎn)未與所檢測到的多態(tài)性分子標(biāo)記連鎖。另外，表型鑒定的誤差也會對QTL的檢出有較大的影響。

前人的研究還表明，玉米穗粒腐病抗性QTL易受群體和環(huán)境條件影響。要檢測到穩(wěn)定的QTL位點(diǎn)，可采用不同群體在相同環(huán)境條件下進(jìn)行QTL分析，盡量減小環(huán)境條件的誤差，以不同群體定位到的共同QTL作為最終的QTL位點(diǎn)；也可以采用相同的群體在不同的環(huán)境條件下進(jìn)行QTL分析，以減小群體對定位結(jié)果的影響，以不同環(huán)境條件下的共同QTL作為最終的定位結(jié)果。因此，在類似的QTL定位研究中，我們必須進(jìn)行多年多點(diǎn)的表型鑒定，以便能檢測到穩(wěn)定QTL位點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究以抗病自交系CML171和感病自交系掖478構(gòu)建的F2群體為作圖群體，構(gòu)建了全長1 396.3 cM的遺傳連鎖圖譜，標(biāo)記間平均遺傳距離為9.43 cM。結(jié)合F2:3家系的抗病指數(shù)數(shù)據(jù)，共檢測到位于第2、3、10染色體上的穗粒腐病抗病指數(shù)QTL3個，分別可以解釋4.6%、5.7%和6.6%的表型變異?；蜃饔梅绞椒謩e為超顯性、超顯性和部分顯性。單個QTL的表型貢獻(xiàn)率均較小，為微效QTL。未檢測到主效QTL。