陳 歡，羅昭標(biāo)

（1.南昌工學(xué)院，江西 南昌 330108；2.江西省煙草公司撫州市公司，江西 撫州 344000）

糖酯是主要的煙葉表面化合物，廣泛存在于許多茄科植物的腺茸毛分泌物中，它們或以蔗糖酯（Sucrose Esters，SE）、葡萄糖酯（Glucose Esters，GE）或其混合物的形式出現(xiàn)。不同類型煙葉中糖酯的含量有所差異，在香料煙中的含量最高，在烤煙中含量居中，而在馬里蘭煙和白肋煙中的含量最低。糖酯類物質(zhì)是煙用香精香料的重要組成成分之一，而且是許多揮發(fā)性香氣成分的前體物。糖酯也是一種表面活性劑，其在煙葉表面容易形成一層油水相隔的保護(hù)膜，具有保香、保濕和保潤(rùn)功效。糖酯還可用作生物殺蟲劑，對(duì)人和恒溫動(dòng)物無毒，同時(shí)具有抗微生物和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)作用[1]。

近年來，糖酯的功能與應(yīng)用日益受到關(guān)注，綜述了煙草中糖酯的分類結(jié)構(gòu)、提取分離、檢測(cè)分析和合成方法等方面的研究進(jìn)展，并提出糖酯在這些方面的研究重點(diǎn)方向，旨在為糖酯研究提供參考。

1 煙草糖酯的分類

葡萄糖酯中，根據(jù)乙?；膫€(gè)數(shù)及取代位置不同，Shinozaki Y等人[2]把煙草中的葡萄糖酯分為3類。

葡萄糖酯的分類見圖1。

圖1 葡萄糖酯的分類

第1種類型的葡萄糖酯，有2個(gè)羥基被乙?；?，分別在C1和C6位，C2，C3，C4位上的羥基被短鏈脂肪酸酯化。第2種類型的葡萄糖酯只有C6位上羥基被乙酰化，C1位置上羥基處于游離狀態(tài)，C2，C3，C4位上羥基被短鏈脂肪酸酯化。第3種類型的葡萄糖酯中沒有乙?；珻1和C6位上羥基都處于游離狀態(tài)，C2，C3，C4位上羥基被短鏈脂肪酸酯化。

蔗糖酯中，根據(jù)乙酰基是取代果糖環(huán)上的羥基還是葡萄糖環(huán)上的羥基，Severson R F等人[3]將煙草中的蔗糖酯分為了3類。

蔗糖酯的結(jié)構(gòu)I-III見圖2。

圖2 蔗糖酯的結(jié)構(gòu)I-III

普通煙草中的糖酯都屬于第1種類型，葡萄糖環(huán)上C6上羥基被乙?；?，C2，C3，C4的羥基被短鏈脂肪酸酯化，果糖環(huán)上的羥基全部處于游離狀態(tài)。Severson R F等人[4]從香料煙表面蠟質(zhì)層分離出一系列這種類型糖酯，并用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將其分為6組，它們有著共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：都是蔗糖四酯，葡萄糖環(huán)上C6被乙?；?，果糖環(huán)上羥基全部游離，C2，C3，C4的羥基被短鏈脂肪酸?；?，短鏈脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度均為2-8。第2種類型和第3種類型的糖酯均存在于黏毛煙草中。

2 煙草糖酯的分析

2.1 煙草糖酯的提取方法

從新鮮煙葉提取糖酯，主要采用浸提法[5]，要求浸提時(shí)間盡量短，以防煙葉內(nèi)部化學(xué)成分被浸出，通常每片葉片浸提3次，每次2～3 s。從調(diào)制后的葉片中提取糖酯，常用超聲波輔助萃取技術(shù)[6]，蔡莉莉等人[7]比較了超聲振蕩法和機(jī)械振蕩法對(duì)煙草中蔗糖酯提取效率的影響，結(jié)果表明，超聲振蕩法更適合用于煙草中蔗糖酯的提取。超聲波輔助萃取技術(shù)具有高效、節(jié)時(shí)、溶劑用量少、萃取完全、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于煙草中各種有效成分的提取中。

提取溶劑的選擇是保證提取效率的關(guān)鍵。根據(jù)“相似相溶”原則選擇，主要為二氯甲烷[7]、三氯甲烷、乙腈[8]等。由于煙葉內(nèi)部物質(zhì)復(fù)雜，每類溶劑都存在一定的局限性。二氯甲烷會(huì)同時(shí)提取出煙葉表面的碳烴化合物，此類物質(zhì)會(huì)對(duì)蔗糖酯的分離產(chǎn)生干擾，選用乙腈為提取溶劑，可避免上述問題[9]。三氯甲烷作提取溶劑，需加入乙醇作保護(hù)劑，而乙醇會(huì)分解衍生化試劑且很難被除去[10]。正己烷等烴類溶劑對(duì)極性的蔗糖酯類物質(zhì)的溶解性比較差，甲醇和丙酮等能與水互溶的揮發(fā)性溶劑會(huì)使煙葉脫水，且非極性的糖酯類物質(zhì)在其中的溶解性不好[11]。

2.2 煙草糖酯的純化方法

糖酯的純化方法主要有硅膠柱色譜法和液相色譜法2種。

2.2.1 硅膠柱色譜法

糖酯中含有羥基，有一定極性，硅膠中也有羥基，它們之間有著氫鍵作用。糖酯和洗脫劑與硅膠之間靠吸附-解析-吸附達(dá)到分離，影響分離的主要因素為糖酯與硅膠間的氫鍵作用力和樣品與洗脫劑間的作用力。因此，選擇合適的洗脫溶劑是有效分離的關(guān)鍵。一種單一溶劑往往難以達(dá)到好的分離效果，常選用混合溶劑以達(dá)到合適的溶劑強(qiáng)度。

硅膠柱層析是運(yùn)用最多的方法，適用于中等分子量的化合物的分離，尤其是脂溶性的成分，層析效果由被分離化合物的性質(zhì)、吸附劑和洗脫劑這3個(gè)因素決定。Severson R F等人[4]將液-液分離后的提取物Sephadex LH-20型凝膠層析柱，用氯仿淋洗，最后分離得到6種蔗糖酯，它們的主要不同是葡萄糖環(huán)上所連的脂肪酸不同。Shinozaki Y等人[2]將煙葉的三氯甲烷萃取物用硅膠柱最后得到4種蔗糖酯。Danehower D[11]用硅膠固相萃取柱分離煙葉的CH2CL2萃取物，氣相（GC）結(jié)果表明煙葉表面總物質(zhì)的50%可以用這種方法洗掉，而99%的蔗糖酯保留在SPE柱上。Kandra O L等人[9]用乙腈作為提取溶劑從煙葉表面提取蔗糖酯類物質(zhì)，用HPLC法氰基柱進(jìn)行分離，共得到4種組分，最后一部分是蔗糖酯。

2.2.2 液相色譜法

液相色譜法就是用液體作為流動(dòng)相，基于混合物中各組分對(duì)兩相親和力的差別進(jìn)行分離的色譜法，根據(jù)吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。

Kandra O L等人[9]將萃取液用氮?dú)獯蹈?，殘余物?0 mL水溶解和20 mL氯仿，分層后棄去水相，氯仿相用無水Na2SO4干燥和氮?dú)獯蹈珊螅俅稳芙庠?0 mL氯仿中，用高效液相色譜法分離，得到4種餾分，最后一種餾分是蔗糖酯。Toshiake M等人[12]利用高效液相色譜法從不同品種煙葉表面提取物中分離得到了不同類型的蔗糖酯。Severson R F等人[13]用反相C18高效液相色譜柱，以乙腈∶水（V∶V）=1∶1為流動(dòng)相，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，得到了糖酯類組分。

2.3 煙草糖酯的檢測(cè)分析

目前，糖酯結(jié)構(gòu)的鑒定主要采用核磁共振（NMR）、紅外（IR）及質(zhì)譜（MS）等方法，定性和定量則采用薄層色譜（TLC）法、液相色譜（HPLC）法或液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS）、氣相色譜（GC）或氣相色譜與質(zhì)譜連用（GC/MS）法。

2.3.1 TLC法

TLC法是從柱色譜發(fā)展而來的，其固定相采用的吸附劑比傳統(tǒng)柱色譜更細(xì)更均勻，具有較高的靈敏度。陽會(huì)兵等人[14]選取7個(gè)烤煙品種作為試驗(yàn)對(duì)象，硅膠板作固定相，選用合適的展開劑和顯色劑，分離和分析了煙葉中的蔗糖酯含量。

2.3.2 GC或GC/MS法

糖酯的分子量較大且揮發(fā)性差，所以無法直接進(jìn)行GC/MS分析，通常需要進(jìn)行衍生化。衍生試劑一般選用N,O-雙-（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺，衍生時(shí)，需二甲基甲酰胺（DMF）作催化劑，水浴加熱，弱極性色譜柱。但是DMF具有較大的極性，會(huì)引起較嚴(yán)重的柱流失。且氣相色譜的檢測(cè)器為EI質(zhì)譜時(shí)，硅烷化糖酯的分子離子峰不會(huì)出現(xiàn)。Einolf等人[15]采用直接化學(xué)離子化質(zhì)譜（DCI/MS）法測(cè)定了煙草中蔗糖酯的含量。該方法中未對(duì)蔗糖酯進(jìn)行衍生，而是使氨氣與蔗糖酯反應(yīng)，這是因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)物的靈敏度和選擇性較高。

2.3.3 LC或LC/MS法

隨著LC/MS越來越多地被運(yùn)用，越來越多的煙草化學(xué)研究者也開始探索該技術(shù)用于煙草中蔗糖酯的研究[16]，尤其是蔗糖酯葡萄糖環(huán)和果糖環(huán)上?；〈愋偷难芯俊horassani M A等人[17]用LC-MS法定性分析蔗糖酯時(shí)發(fā)現(xiàn)，蔗糖酯的酰基取代基的碳骨架中存在著不飽和鍵。

LC法可以直接對(duì)樣品進(jìn)行分析，不需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，但是由于糖酯類的紫外吸收很弱，液相色譜法中常規(guī)檢測(cè)器紫外檢測(cè)器無法滿足分析的要求，示差折光檢測(cè)器雖然可以用于分析，但其靈敏度較低，且不能進(jìn)行梯度洗脫，所以目前運(yùn)用LC法對(duì)煙葉中糖酯尤其是葡萄糖酯的分析很少見。

3 煙草糖酯的合成

3.1 煙草體內(nèi)生物合成

煙草中的葡萄糖酯和蔗糖酯是在煙草茸毛腺細(xì)胞中合成的，是腺細(xì)胞的分泌物，這種分泌物連同煙草表皮和亞表皮分泌物一起在煙草的表面積累[18]，煙草和其他植物腺細(xì)胞合成蔗糖酯的主要原料是支鏈氨基酸和蔗糖新陳代謝產(chǎn)生的活化酸[19-20]。腺毛細(xì)胞有可能是進(jìn)行生物合成的唯一場(chǎng)所，同樣的長(zhǎng)鏈腺毛類型可以產(chǎn)生主要的流出成分，研究發(fā)現(xiàn)分離的腺毛細(xì)胞可以在有燈光的情況下從CO2合成蔗糖酯，這表明腺毛細(xì)胞可以進(jìn)行光合作用，蔗糖和葡萄糖還可以通過碳酸氫鹽合成蔗糖酯的蔗糖部分，因此，蔗糖酯的蔗糖或葡萄糖部分是由轉(zhuǎn)移到腺體中的多糖經(jīng)過蔗糖酶轉(zhuǎn)化為蔗糖的[9]。蔗糖酯的酰基部分可能是直鏈的也可能是支鏈的（異構(gòu)的或反異構(gòu)的），它們可能是通過2種途徑合成的：①脂肪酸合成酶或加長(zhǎng)酶代謝；②α-酮酸加長(zhǎng)途徑（α-KAE）。Kandra A B和Netab B[21-22]等人發(fā)現(xiàn)，煙草中蔗糖酯的?；糠质峭ㄟ^α-KAE即支鏈氨基酸代謝的一種改進(jìn)形式衍生的，該途徑中?；饕怯搔?KAE衍生的2-甲基丁?；o酶A(CoA)經(jīng)過2-甲基支鏈CoA脫氫酶的轉(zhuǎn)化生成。引起煙草蔗糖酯酰基鏈型差異（異構(gòu)或反異構(gòu)、支鏈和直鏈）的原因尚不明確，可能是α-KAE的一種關(guān)鍵酶的底物專一性造成的[23]，可能是因?yàn)棣?KAE中某些鏈的終止機(jī)制可導(dǎo)致酰基鏈長(zhǎng)的差異，但這種推測(cè)還沒有被證實(shí)。目前，蔗糖酯合成中的酶及其調(diào)控基因還未得到分離和鑒定出，也未了解某些蔗糖酯中的乙?；诠黔h(huán)上（C2，C3）和酰基在葡萄糖環(huán)上（C2，C3，C4）取代專一性的原因。

Kandra O L等人[9]研究了煙草腺毛中糖酯的形成及代謝過程。研究過程中將煙草腺毛細(xì)胞與表皮和亞表皮細(xì)胞分離開，2種細(xì)胞一起分別用CO2加乙酸酯培養(yǎng)，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有帶腺毛細(xì)胞的體系能產(chǎn)生蔗糖酯。Einolf W N等人[24]對(duì)不同類型的煙草生長(zhǎng)過程中的蔗糖酯含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，香料煙生長(zhǎng)過程中蔗糖酯的累積量最高，其次是白肋煙，烤煙的積累量最少；并且隨著煙草的生長(zhǎng)，其含量呈現(xiàn)出先增高后降低然后再增高的趨勢(shì)，并且含量在完熟時(shí)達(dá)到最高。

3.2 煙草體外化學(xué)合成

煙草中糖酯的結(jié)構(gòu)比較特殊，用化學(xué)法合成，難度較大，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)糖酯的合成的報(bào)道較少。最早合成出的糖酯是一種葡萄糖酯，即6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-（3-甲基戊?；?β-D-吡喃葡萄糖，對(duì)這種物質(zhì)的鑒定是采用與從煙草中分離純化出的這種糖酯的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，從而確定其結(jié)構(gòu)。葡萄糖四元酯的合成以6-O-乙?；?2,3,4-三-O-異丁?；?β-D-吡喃葡萄糖酯為例，其合成方法為以β-D-甲基吡喃葡萄糖苷為起始原料通過羥基保護(hù)和去保護(hù)法選擇性地合成目標(biāo)產(chǎn)物。

煙草中蔗糖四元酯的合成過程需要先合成得到中間體6-O-乙酰基-3-O-烯丙基-1',3',4',6'-四-O-芐基-2-O-(4-甲氧基芐基)蔗糖。該中間體中的1',3',4',6'的羥基都連有芐基，從而起到保護(hù)這些位置羥基的作用，2,4位羥基通過酯化作用變成酰基，3位的烯丙基可以通過異構(gòu)化和水解作用使其變成酰基。通過這一中間體合成的糖酯結(jié)構(gòu)與煙草中所含糖酯的結(jié)構(gòu)相同。Garegg R J等人[25]以蔗糖為原料，成功合成出6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-[(S)-3-甲基戊?；鵠蔗糖。Oscarson S等人[26]研究得到6-O-乙?；?2,3,4-三-O-[(S)-2-甲基丁?；鵠蔗糖和6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-[(S)-2-甲基丁?；鵠-二-O-[(S)-3-甲基戊酰基]蔗糖的3種同分異構(gòu)體的合成方法。

4 結(jié)語

由于對(duì)煙草中的糖酯進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析需要參考標(biāo)樣，而糖酯類物質(zhì)在煙草中的含量很低，尤其是葡萄糖酯，且異構(gòu)體較多，所以通過從煙草提取物中分離得到糖酯的純品，難度較大，因此化學(xué)法合成糖酯的方法還有待繼續(xù)研究。

目前關(guān)于煙草糖酯的研究不少，但大多數(shù)研究仍在沒有標(biāo)樣的情況下用GC/MS或LC/MS進(jìn)行，且主要集中于蔗糖酯，研究?jī)?nèi)容主要為提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析，對(duì)于葡萄糖酯，相關(guān)的報(bào)道只是關(guān)于提取分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，定量分析的很少，因此葡萄糖酯的定量分析也是研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。