王 偉，楊 錕，梅子龍，余華順，戴秋紅，任立偉，龔大春

（1.三峽大學(xué)湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司酶制劑事業(yè)部，湖北 宜昌 443002）

0 引言

近平滑假絲酵母ATCC7330是一種具有優(yōu)異生物氧化還原催化性能的酵母，廣泛用于手性藥物中間體的綠色催化合成中[1]。但整細胞催化時底物濃度較低，反應(yīng)介質(zhì)常常對細胞毒性較大，不利于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。因此，將近平滑假絲酵母破碎后獲取重要的羰基還原酶，然后利用酶用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中的生物催化合成具有非常重要意義。

酵母細胞壁較厚，難于破碎，必須采用外力或生物法才能使胞內(nèi)物質(zhì)得到釋放。酵母細胞破碎的方法主要有物理破碎、化學(xué)破碎和生物酶法破碎等[2-5]。其中，物理破碎有超聲波破碎、均質(zhì)破碎、爆破破碎等方法；化學(xué)破碎要使用化學(xué)藥劑，對于后處理加工帶來比較大的麻煩；生物酶法破碎[3]是最近幾年興起的一種新的方法，效果比化學(xué)破壁好，但專用酶的成本較高，如果要獲取的目標產(chǎn)物是胞內(nèi)酶，必然會增加二次分離難度；而高壓均質(zhì)法物理破 碎[6-9]具有操作簡單、處理量大、二次分離容易等優(yōu)勢，特別適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

因此，試驗選用高壓均質(zhì)物理方法對近平滑假絲酵母進行破碎研究，考查了酵母質(zhì)量分數(shù)、均質(zhì)壓力、均質(zhì)時間和均質(zhì)次數(shù)等對分離酮基還原酶的效果影響，以期獲得比較好的粗酶初步分離方法，為酮基還原酶的進一步純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 試劑

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司提供；蔗糖、乳糖、木糖，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

JN-minBC型超高壓納米均質(zhì)機，廣東聚能納米生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 菌株和培養(yǎng)基

近平滑假絲酵母（Candidaparapsilosis）ATCC7330，實驗室保藏；斜面保藏培養(yǎng)基：蔗糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L；種子培養(yǎng)基：蔗糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L。

2 試驗方法

2.1 近平滑假絲酵母ATCC7330的制備

參考文獻[1]的方法，利用最優(yōu)條件下最優(yōu)培養(yǎng)基配方和工藝：蔗糖34.64 g/L，(NH4)2HPO416 g/L，硫酸鎂0.80 g/L，酵母浸粉6.0 g/L；最佳培養(yǎng)初始pH值5.0，最佳通風量3.0 L/min，培養(yǎng)近平滑假絲酵母ATCC7330，離心收集菌體。

2.2 高壓均質(zhì)破碎操作

（1）接通總電源，整機通電。將鑰匙插入工作/鎖定轉(zhuǎn)換孔，并旋到工作位置。

（2）進樣杯中加滿純凈水或緩沖液，按“液壓泵”“開”按鈕（綠色），油泵啟動，供油壓力輸入主附油缸。

（3）按“主機”“開”按鈕，機器正常運轉(zhuǎn)（往復(fù)運動）。

（4）順時針緩慢調(diào)節(jié)調(diào)壓閥，使低壓表、高壓表的壓力同步上升，根據(jù)樣品種類，需用不同的破碎壓力（200 MPa以下）進行試驗。

（5）添加不同質(zhì)量分數(shù)的酵母緩沖液到達進樣杯頸部時，按“主機”“關(guān)”按鈕，機器停止運轉(zhuǎn)。將待破碎樣品加入進樣杯中，按“主機”“開”按鈕，細胞破碎開始。經(jīng)均質(zhì)閥破碎后的樣品，沿循環(huán)冷卻管路冷卻后，從出樣口流出，樣品一次破碎完成（可根據(jù)需要進行多次破碎）。

（6）樣品破碎完后，逆時針調(diào)節(jié)調(diào)壓閥，使右邊低壓表至“0”位，加入純凈水或75%酒精進行清洗，直至出樣清澈。

（7）按左邊紅色“主機”“關(guān)”按鈕，再按右邊紅色“液壓泵”“關(guān)”按鈕；逆時針打開卸壓閥，使高壓表回“0”位。卸壓完畢后，立即順時針關(guān)上卸壓閥。

（8）關(guān)掉總電源，拔掉電源線。

2.3 酮基還原酶酶活的測定

酶活定義為1 min內(nèi)消耗1μMNAD(P)H所需要的酶量為一個酶活單位。

基本步驟：將緩沖液、底物和輔酶依次加入后于30℃下保溫2 min，加入適量酶液后讀取1 min內(nèi)的于波長340 nm處吸光度的下降值。

反應(yīng)體系：700μLpH值7.5的PB緩沖液，濃度為30 mmol/L的底物100μL，濃度為2 mmol/L的NAD(P)H，酶液100μL。

2.4 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選定均質(zhì)溫度、酵母質(zhì)量分數(shù)、均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)作為4個因素，在3個水平上進行設(shè)計，測定粗酶液酶活，用于正交設(shè)計分析。

近平滑假絲酵母ATCC7330高壓均質(zhì)破碎因素與水平設(shè)計見表1。

表1 近平滑假絲酵母ATCC7330高壓均質(zhì)破碎因素與水平設(shè)計

3 結(jié)果與分析

3.1 近平滑假絲酵母ATCC7330均質(zhì)破碎正交試驗粗酶液酶活分析

根據(jù)單因素試驗表明，溫度高對于細胞破碎是有利的，但是溫度太高，容易導(dǎo)致酶失活，不利于粗酶的提取。因此，選用4～8℃作為優(yōu)化范圍。均質(zhì)進料的酵母質(zhì)量分數(shù)對于均質(zhì)液的黏度會產(chǎn)生較大影響，因此通過單因素試驗選取了10%～20%的質(zhì)量分數(shù)。均質(zhì)壓力對于酵母細胞破壁會產(chǎn)生較大沖擊力，對酵母的破碎率是正相關(guān)的，因此壓力的選取至關(guān)重要，但設(shè)備的最高壓力為200 MPa，因此選用了100～180 MPa的范圍進行試驗。均質(zhì)次數(shù)是根據(jù)一次均質(zhì)的效果來確定的。由于均質(zhì)操作速度快，一次破壁效果不一定好，因此采用2.4的正交設(shè)計表進行9次試驗。

近平滑假絲酵母ATCC7330均質(zhì)破碎正交試驗均值和極差見表2。

3.2 近平滑假絲酵母ATCC7330均質(zhì)破碎最優(yōu)條件確定與驗證

通過9次試驗，利用正交設(shè)計軟件極差分析可以看出，均質(zhì)溫度、酵母質(zhì)量分數(shù)、均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)4個因素中對酵母近平滑假絲酵母破碎提取酮基還原酶粗酶液的影響依次為均質(zhì)壓力＞酵母質(zhì)量分數(shù)＞均質(zhì)溫度＞均質(zhì)次數(shù)。通過正交設(shè)計軟件均值分析可以看出，酵母近平滑假絲酵母破碎提取酮基還原酶的粗酶液的最佳工藝條件為均質(zhì)溫度6℃，酵母質(zhì)量分數(shù)20%，均質(zhì)壓力180 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次。經(jīng)過驗證試驗，可以得到粗酶液酶活1.572 U/mL，比優(yōu)化前提高19%。

表2 近平滑假絲酵母ATCC7330均質(zhì)破碎正交試驗均值和極差

3.3 近平滑假絲酵母破碎顯著性因素分析

通過正交試驗軟件分析，在a=0.10條件下，均值溫度、酵母質(zhì)量分數(shù)、均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)4個因素對酵母近平滑假絲酵母均質(zhì)破碎提取酮基還原酶的粗酶液具有顯著性影響的是均質(zhì)壓力，所以在均質(zhì)機壓力允許的條件下，盡可能控制在較高壓力。通過優(yōu)化選取180 MPa為宜。

近平滑假絲酵母ATCC7330高壓均質(zhì)破碎正交試驗方差分析見表3。

表3 近平滑假絲酵母ATCC7330高壓均質(zhì)破碎正交試驗方差分析

4 結(jié)論

通過正交試驗設(shè)計，考查了均質(zhì)溫度、酵母質(zhì)量分數(shù)、均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)對酵母近平滑假絲酵母均質(zhì)破碎提取酮基還原酶的粗酶液效率的影響，得出4個因素的影響大小為均質(zhì)壓力＞酵母質(zhì)量分數(shù)＞均質(zhì)溫度＞均質(zhì)次數(shù)，其中均質(zhì)壓力為近平滑假絲酵母破碎的顯著性因素，最佳破碎工藝為均值溫度6℃，酵母質(zhì)量分數(shù)20%，均質(zhì)壓力180 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次。經(jīng)過驗證試驗，可以得到粗酶液酶活1.572 U/mL，比優(yōu)化前提高150%以上。