史玉寶，白衛(wèi)東，趙文紅，錢 敏，白永亮

（1.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225）

桑黃屬珍稀藥用真菌，因其通常生長(zhǎng)在桑屬植物上，子實(shí)體顏色鮮黃而得名。最早記載于《藥性論》，之后歷代本草學(xué)中多有記載，其味甘辛、無(wú)毒，用于治療血崩、血淋、脫肛瀉血、帶下、經(jīng)閉[1]。目前開(kāi)發(fā)的桑黃原料主要是子實(shí)體[2]和菌絲體[3]，主要活性物質(zhì)為多酚類物質(zhì)[4]、黃酮類化合物[5]和多糖[6]，還含有萜類化合物、甾醇類、香豆素類、吡喃酮類、呋喃類和氯化產(chǎn)物等多種活性成分[7-9]。其中，研究較多的是桑黃多糖，結(jié)果表明桑黃多糖具有抗腫瘤[10-13]、增強(qiáng)免疫[14]、抗氧化[15]、抗炎[16-17]和降血糖等作用[18-20]。

由于桑黃資源稀少，開(kāi)發(fā)較晚，國(guó)內(nèi)外對(duì)桑黃多糖的研究尚處于初步階段。目前，關(guān)于桑黃多糖提取方法的研究主要集中在熱水法[21]、超聲輔助法[22-24]、復(fù)合酶輔助法[25]、發(fā)酵法[26-27]、低溫低壓法[28]和微波提取法[29-30]。桑黃子實(shí)體中的多糖是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的主要成分，與纖維素、蛋白質(zhì)等緊密結(jié)合在一起，不易分離。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)桑黃多糖的提取研究報(bào)道較多，酶解輔助提取技術(shù)較其他的方法更高效節(jié)能。試驗(yàn)在對(duì)比了不同蛋白酶的酶解效果基礎(chǔ)上，選取了木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解提取工藝的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）桑黃子實(shí)體。采自長(zhǎng)白山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)鑒定后粉碎過(guò)篩備用；木瓜蛋白酶（60×104U/g），南寧龐博生物工程有限公司提供；其他試劑均為化學(xué)純或分析純。

（2）6%苯酚溶液。精確稱取6 g重蒸苯酚，置于100 mL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。

（3）木瓜蛋白酶。精確稱取0.2 g的木瓜蛋白酶粉末，溶解，置于100 mL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。

（4）DNS試劑。酒石酸鉀鈉182 g，溶于500 mL蒸餾水中，加熱（不超過(guò)50℃），于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3 g，NaOH21 g，苯酚5 g，無(wú)水亞硫酸鈉5 g，攪拌均勻，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中，室溫下放置7 d后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

BS110S型精密電子天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空抽濾機(jī)，鞏義市英峪予華儀器廠產(chǎn)品；752N型紫外線可見(jiàn)光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 還原糖的測(cè)定——DNS法

精確稱取105℃干燥恒質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖50 mg，定容于100 mL容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。按表1添加試劑于10 mL具塞試管，沸水浴5 min，然后迅速流水冷卻，定容至10 mL，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以吸光度為橫坐標(biāo)，繪制還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.354 9X+0.015 6，R2=0.999 3，其中Y為葡萄糖質(zhì)量濃度，X為吸光度。

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑用量見(jiàn)表1。

表1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑用量/mL

1.3.2 總糖含量的測(cè)定——硫酸—苯酚法

精確稱取105℃干燥恒質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100 mg，定容于100 mL容量瓶，配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液，取上述母液10 mL于100 mL容量瓶中，配置成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

按表2添加試劑后，振蕩混勻，于室溫下放置30 min，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值，做3個(gè)平行，求平均值。以葡萄糖質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.163 7X-0.003 8，R2=0.999 1，其中Y為葡萄糖質(zhì)量濃度，X為吸光度。

總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑用量見(jiàn)表2。

表2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑用量/mL

1.3.3 多糖含量的測(cè)定

多糖含量=總糖含量-還原糖含量.

吸取樣品液1.0 mL，按上述步驟操作，測(cè)光密度，按回歸方程求出樣品溶液中總糖含量。

吸取樣品液2.0 mL，按上述步驟操作，測(cè)光密度，按回歸方程求出樣品溶液中還原糖含量。

1.3.4 工藝流程

桑黃子實(shí)體干燥粉碎→過(guò)目（60目）→酶解→滅酶→→抽濾→上清液→測(cè)定多糖含量。

1.3.5 桑黃多糖單因素提取條件研究

（1）酶添加量的選擇。稱取5份桑黃樣品各1 g，在確定的料液比、提取時(shí)間和提取溫度的條件下，分別于按照0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%添加木瓜蛋白酶進(jìn)行提取，測(cè)定提取液中粗多糖的質(zhì)量濃度，比較酶添加量對(duì)多糖提取率的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次。

（2）提取溫度的選擇。稱取5份桑黃樣品各1 g，在確定的料液比、提取時(shí)間和酶添加量的條件下，分別于不同溫度如30，40，50，60，70℃下提取，測(cè)定提取液中粗多糖的質(zhì)量濃度，比較提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次。

（3）料液比的選擇。稱取5份桑黃樣品各1 g，在確定的提取時(shí)間、提取溫度和酶添加量的條件下，分別按照不同料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50進(jìn)行提取，測(cè)定提取液中粗多糖的質(zhì)量濃度。比較料液比對(duì)多糖提取率的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次。

（4）提取時(shí)間的選擇。稱取5份桑黃樣品各1 g，在確定的料液比、提取溫度和酶添加量的條件下，分別選用不同的提取時(shí)間20，40，60，80，100 min，測(cè)定提取液中粗多糖的質(zhì)量濃度，比較提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，確定木瓜蛋白酶的添加量為0.3%，用正交試驗(yàn)對(duì)酶解時(shí)間、酶解溫度和料液比進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，每組條件下取桑黃樣品1 g，分別用酶解提取3次，確定粗多糖的質(zhì)量濃度。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

表3 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2.1.1 木瓜蛋白酶添加量對(duì)多糖提取率的影響

木瓜蛋白酶添加量對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 木瓜蛋白酶添加量對(duì)多糖提取率的影響

由圖1可知，在木瓜蛋白酶添加量小于0.3%時(shí)，提取率隨添加量的增加而迅速提高，在大于0.3%時(shí)，提取率變化不明顯，趨于平穩(wěn)。說(shuō)明在木瓜蛋白酶的添加量達(dá)到0.3%時(shí)，酶對(duì)反應(yīng)物的催化作用逐漸達(dá)到飽和，再增加酶的添加量，也是增加酶的消耗量，而對(duì)反應(yīng)沒(méi)有太大影響。所以選擇木瓜蛋白酶的最佳添加量為0.3%。

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

提取溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖2可知，提取率先隨著溫度的提高不斷提高，提取溫度為50℃時(shí)提取率達(dá)到最大，說(shuō)明在較低溫度時(shí)，木瓜蛋白酶的活性隨著溫度的升高而增大。高于50℃后，總體提取率降低，且呈現(xiàn)不規(guī)律的波動(dòng)現(xiàn)象，但差異不顯著。這可能可能由于溫度超出了木瓜蛋白酶的活性范圍，酶發(fā)生變性或者活力下降，從而使酶催化反應(yīng)不能正常進(jìn)行。所以在其他條件一定時(shí)，選擇50℃為最佳提取溫度。

2.1.3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

料液比對(duì)提取率有顯著的影響，選擇的比例過(guò)大，會(huì)減少了酶與底物作用的幾率，比例過(guò)小，有關(guān)溶劑的用量和能耗都會(huì)大量增加。

料液比對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著物料濃度的減小，多糖提取率先上升后下降，提取率在料液比為1∶30時(shí)最大。因此，選擇最佳料液比為1∶30。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖4可知，提取時(shí)間對(duì)多糖提取率有明顯的影響，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)多糖提取率先升高后降低，在提取時(shí)間為60 min時(shí)提取率達(dá)到最大。說(shuō)明在提取時(shí)間小于60 min時(shí)，隨反應(yīng)的進(jìn)行提取出的多糖增多。而在提取時(shí)間大于60 min時(shí)，在提取完全后，隨著加熱的繼續(xù)進(jìn)行，使反應(yīng)產(chǎn)物多糖發(fā)生降解，從而使反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物變少。因此，選擇最佳提取時(shí)間為60 min。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析，由R值可知，所選因素對(duì)桑黃多糖提取率的影響由大到小依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比。最優(yōu)工藝為A1B2C3，即提取時(shí)間40 min，提取溫度50℃，料液比1∶40。采用優(yōu)化工藝參數(shù)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)，平均提取率達(dá)到1.52%，且表明該工藝較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

桑黃子實(shí)體中粗蛋白含量達(dá)到5.48%，是多糖含量的2倍多，菌絲體中粗蛋白更是達(dá)到36.46%[31]。脫除蛋白的桑黃多糖才能更好地進(jìn)行相關(guān)研究，有利于桑黃多糖的純化工藝和結(jié)構(gòu)分析。目前已有很多研究通過(guò)各種方法（Sevag法、三氯醋酸法和三氯醋酸與酶結(jié)合法）除去桑黃粗多糖提取液的蛋白，以進(jìn)行下一步的純化分析。但是這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如在酸性條件脫除蛋白可能會(huì)影響桑黃多糖的活性[31-33]。因此，如果在桑黃多糖提取的過(guò)程中通過(guò)酶解的方法除去粗蛋白或與多糖結(jié)合的蛋白，可為后續(xù)工作提供便利，節(jié)約能源。試驗(yàn)在對(duì)比了多種蛋白酶的酶解效果基礎(chǔ)上，選取了木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解輔助提取工藝優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化分析，確定了酶解輔助提取桑黃多糖的工藝參數(shù)為木瓜蛋白酶添加量0.3%，提取時(shí)間40 min，提取溫度50℃，料液比1∶40（g∶mL）。以期為桑黃多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)測(cè)定及藥理活性的研究奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果